(遼寧師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,遼寧省植物生物技術(shù)重點實驗室,遼寧 大連 116029)

裙帶菜(Undaria pinnatifida)是我國重要的養(yǎng)殖經(jīng)濟海藻之一,年產(chǎn)量僅次于海帶和紫菜居第三位。裙帶菜分類地位隸屬于褐藻門(Phaeophyta)、海帶目(Laminariales)、翅藻科(Alariaceae)、裙帶菜屬(Undaria),為溫帶性海藻,野生種類主要分布于中國、韓國和日本等亞洲北部地區(qū)[1]。裙帶菜具有二倍的孢子體和單倍的配子體所組成的異型世代交替的生活史,具有獨立的生殖器官和簡單的根莖葉分化,因此被認為是較高等的大型海藻。由于裙帶菜配子體個體微小,細胞壁較薄,黏液腺等分泌結(jié)構(gòu)不發(fā)達,種質(zhì)保存技術(shù)成熟等特殊的優(yōu)勢,近些年來被作為首選的大型海藻研究材料應(yīng)用于遺傳育種、細胞工程化育苗和分子生物學(xué)等相關(guān)研究領(lǐng)域[2]。

裙帶菜及其配子體富含多糖、多酚和次生代謝物質(zhì),它們易與核酸結(jié)合形成不溶于水的復(fù)合物,同時在提取過程中這些物質(zhì)也是多種酶類的抑制劑,因此裙帶菜RNA的提取是廣泛開展裙帶菜分子生物學(xué)研究的主要難點之一。目前一些商業(yè)化的試劑盒(如Trizol等)被廣泛應(yīng)用于植物總RNA的提取純化,但專門用于大型海藻總RNA提取的試劑盒還沒有被開發(fā)應(yīng)用。本文以裙帶菜配子體為材料,對幾種常見的總RNA提取方法進行了比較研究,優(yōu)化了提取過程,為大型海洋藻類分子生物學(xué)研究的開展提供了基本技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

裙帶菜(U.pinnatifida)配子體由本實驗室自行保存,擴大培養(yǎng)方法：溫度20℃,光照強度20 μmol/(m2·s),光周期 12 h ：12 h,培養(yǎng)液 PES 每7天更換一次。

條斑紫菜(Porphyra yezoensis)絲狀體由遼寧省植物生物技術(shù)重點實驗室海洋藻類研究室提供,培養(yǎng)條件：溫度 20℃,光照強度 30 μmol/(m2·s),光周期14 h ：10 h,培養(yǎng)液PES每7天更換一次。

海帶(Laminaria japonica)配子體為實驗室自行保存,擴大培養(yǎng)方法：溫度 18℃,光照強度 20 μmol/(m2·s),光周期 12 h ：12 h,培養(yǎng)液 PESI每 7 天更換一次。

1.2 實驗方法

1.2.1 裙帶菜配子體總RNA提取

1.2.1.1 改進SDS法

取材料0.1g用蒸餾水沖洗2次,滅菌濾紙吸干水分,液氮研磨,轉(zhuǎn)移至離心管中,加入 80℃預(yù)熱的SDS提取液1mL(100 mmol/L LiCl,100 mmol/L Tris,50 mmol/L EDTA,2% SDS,使用前加16% PVP和1% β-巰基乙醇),充分振蕩混勻,置冰上5 min。4 ℃、12 000g離心 10 min。取上清,加 200 μL 3mol/L KAc(pH5.5),勻冰上放置5 min。4℃、12 000g離心10 min。取上清,加200 μL氯仿,充分振蕩抽提,冰上放置5 min。4 ℃、12 000g離心15 min。小心吸取上層水相于新離心管中,加600 μL預(yù)冷的異丙醇,混勻后-20℃沉淀20 min。4℃、12 000g離心10 min。1mL 75%乙醇(DEPC處理)洗滌 2次,室溫干燥,20 μLDEPC水溶解,-80℃保存。

1.2.1.2 CTAB法

取液氮研磨好的材料 0.1 g于離心管中,加入CTAB提取液1mL(100 mmol/L Tris-HCl(pH8.0),50 mmol/L EDTA,2 mol/L NaCl,2% CTAB,使用前加1% DTT),充分混勻,置冰上5 min。4℃、12 000g離心10 min。取上清,加等體積氯仿：異戊醇(24：1),充分振蕩抽提,冰上放置5 min。4℃、12 000g離心15 min。小心吸取上層水相于新離心管中,加1/4體積10 mol/L LiCl,混勻后-20℃沉淀過夜。4℃、12 000g離心10 min。棄上清,1 mL 75%乙醇(DEPC處理)洗滌2次,室溫干燥,20 μL DEPC水溶解,-80℃保存。

1.2.1.3 Trizol試劑盒法

根據(jù)Invitrogen公司 Trizol試劑盒提供的操作流程提取。每 0.1g液氮研磨的材料加 1mL Trizol試劑,充分混勻室溫放置5 min,加200 μL氯仿,用力震蕩混勻,室溫放置5 min。4℃、12 000g離心15 min。小心吸取上層水相于新離心管中,加 500 μL預(yù)冷的異丙醇,混勻后室溫沉淀 5 min。4℃、12 000g離心10 min。棄上清,1 mL 75%乙醇(DEPC處理)洗滌兩次,室溫干燥,20 μLDEPC 水溶解,-80℃保存。

1.2.1.4 RNAiso Reagent 植物總RNA提取試劑盒

實驗方法根據(jù)寶生物公司(TAKARA)RNA提取試劑盒(RNAiso Reagent)操作流程。每0.1g液氮研磨的材料加 1mL RNAiso Reagent,混勻室溫靜置5 min。12 000g4℃離心5 min。取上清,加入氯仿(RNAiso Reagent的1/5體積量),用力震蕩,室溫靜置5 min。12 000g4℃離心15 min。取上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中,加入等體積的異丙醇,充分混勻后在室溫靜置10 min。 12 000g4℃離心10 min。棄上清,75%乙醇(DEPC處理)洗滌2次,室溫干燥,20 μL DEPC水溶解,-80℃保存。

1.2.2 RNA樣品中DNA的去除

按照下列反應(yīng)體系在離心管中依次加入 RNA 20 μL,10×buffer 10 μL,DNaseI 4μL,RNase Inhibitor 1μL,DEPC-H2O 65μL。37℃反應(yīng) 30 min,然后加入等體積氯仿抽提,4℃、12 000g離心15 min。取上層水相,加 1/5體積 3 mol/LNaAc和 2倍體積無水乙醇,-80℃沉淀2 h。75%乙醇(DEPC處理)洗滌兩次,室溫干燥,20 μL DEPC水溶解,-80℃保存。

1.2.3 RNA純度的檢測

1μLRNA樣品于1%瓊脂糖凝膠電泳,1×TAE緩沖液中120 V電泳20 min。EB浸泡膠后凝膠成像系統(tǒng)成像。取1μL RNA樣品稀釋100倍后于紫外分光光度計測定A260和A280的值,計算A260/A280確定RNA純度。

1.2.4 RT-PCR檢測

將消化處理后的 RNA樣品用 AMV反轉(zhuǎn)錄酶(TAKARA)按常規(guī)的方法進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),以GST(谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶)基因設(shè)計引物進行 PCR反應(yīng)。20 μL PCR 反應(yīng)體系組成如下：10×buffer 2μL;Taq 酶 0.2μL;dNTP 3.2 μL;模板 5 μL;上下游引物各 0.2 μL;DEPC-H2O 9.2 μL。反應(yīng)條件：94℃ 5 min,94℃1 min,55℃1 min,72℃ 30 s,35 個循環(huán),72℃10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果

2.1 RNA電泳檢測

各種方法提取獲得的總RNA電泳結(jié)果見圖1。其中圖1-A為改進SDS法提取總RNA的電泳圖譜,可見28s、18s rRNA條帶分離明顯清晰,28s、18s條帶亮度比 5s大,表明其完整性良好;點樣孔中無DNA殘留痕跡,28s條帶上方無彌散拖尾現(xiàn)象,沒有多糖、蛋白等雜質(zhì)的污染;A260/A280比值為1.98,表明這種方法獲得的RNA純度較高;但電泳圖譜中可見有少許的基因組 DNA殘留,用 DNaseI消化處理后再電泳結(jié)果見圖2-A,基因組DNA消失,rRNA條帶保持完整,A260/A280為 1.85。從圖1-B泳道可見CTAB法提取的總RNA明顯有降解,18s帶亮度很大,向下呈現(xiàn)彌散狀態(tài);總 RNA中有蛋白和多糖污染;基因組DNA殘留非常明顯。用兩種試劑盒提取則沒有能夠得到完整的RNA(見圖1-C和1-D),只有少量的5s條帶存在。

圖1 裙帶菜配子體總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.1 Agarose gel electrophoresis of Total RNAs from U.pinnatifida gametophyte

2.2 RT-PCR檢測

選擇改進SDS法提取的總RNA用DNaseI消化處理后,進行反轉(zhuǎn)錄和 PCR擴增反應(yīng),結(jié)果見圖2-B。擴增結(jié)果特異性強,無非特異性條帶出現(xiàn),說明提取的總RNA質(zhì)量較好,可用于基因克隆等后續(xù)實驗研究。

圖2 DNaseI消化處理后的總RNA及RT-PCR瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.2 Agarose gel electrophoresis of DNaseI digested total RNA and RT-PCR products

3 分析與討論

近幾年來已經(jīng)有了一些關(guān)于大型海藻 RNA提取的報道,但裙帶菜等褐藻類的研究報道數(shù)量有限(表1)。很多研究表明,大型海藻總RNA提取所采用的方法主要是 CTAB法,多用于基因克隆、文庫構(gòu)建和提取方法的比較等。CTAB和SDS是比較常用的蛋白質(zhì)變性劑,能有效地裂解細胞膜并抑制核酸酶的活性,釋放出細胞內(nèi)容物并使核酸-蛋白復(fù)合物分解以便釋放核酸。韓峰等[3]認為CTAB 去除海藻多糖效果顯著,結(jié)合有效的抽提和純化方法能得到高純度的DNA。楊婧等[4]利用幾種不同的方法提取綠色巴夫藻(Pavlova viridis)總RNA,比較分析后認為CTAB-酸酚法最為適合。但作者在實驗中發(fā)現(xiàn),CTAB法提取的總RNA含有基因組DNA的量普遍比SDS方法高,且實驗耗時較長,一次提取實驗需兩天才能完成。

改進的SDS法采用16% PVP和1%β-巰基乙醇相結(jié)合的方法來抑制酚類物質(zhì)的氧化作用并將其有效的去除。PVP是多酚的螯合劑,β-巰基乙醇則是高效的還原劑,為PVP和酚的結(jié)合提供了良好的環(huán)境,二者結(jié)合防止多酚氧化的效率大大提高[5]。高濃度的鹽能夠沉淀多糖,3 mol/L KAc(pH5.5)沉淀多糖的同時能提供偏酸性的環(huán)境,這時 RNA穩(wěn)定而 DNA則容易變性沉淀下來,利用后續(xù)的抽提即可將其除去,從而分離得到較高質(zhì)量的RNA。雖然仍有少量基因組DNA殘留,但利用DNaseI可有效去除DNA污染。該方法耗時短,約5～6 h即可完成總RNA提取。為檢驗該方法有效性的適應(yīng)范圍,作者用這種方法提取了海帶配子體、條斑紫菜絲狀體的總 RNA,均獲得了較好的結(jié)果(見圖3-A和3-B)。

圖3 海帶配子體和條斑紫菜絲狀體總 RNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.3 Agarose gel electrophoresis for total RNA extracted from L.japonica gametophyte and P.yezoensis conchocelis

表1 大型海藻總RNA提取主要方法及其用途Tab.1 Methods to extract total RNA from seaweeds

Trizol和RNAiso Reagent是基于異硫氰酸胍法的原理而設(shè)計配制的高效RNA提取試劑盒,更適合于動物組織和細胞總RNA提取,也適用于某些植物總RNA提取。我們的實驗結(jié)果表明這2種試劑盒對條斑紫菜 RNA提取效果很好(圖3-C)。而對裙帶菜配子體總RNA提取效果不佳。

研究結(jié)果表明,改進的 SDS法是裙帶菜配子體總RNA提取行之有效的方法,并可以將該方法應(yīng)用于褐藻類和其他大型海藻的RNA提取。該方法表現(xiàn)出提取過程耗時少,得到的RNA質(zhì)量較高等明顯優(yōu)勢,獲得的RNA可以用于基因克隆、差異顯示分析、分子雜交等各種分子生物學(xué)研究。

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