張 瑩,賈英杰,楊 潔,李小江

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科,天津 300193;2.天津中醫(yī)藥大學(xué) 2007級(jí)碩士研究生,天津300193)

腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性(multid rugresistance, MDR)是肺癌化療的重要障礙。化療可以通過(guò)多種途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)殺傷腫瘤細(xì)胞,因此腫瘤細(xì)胞對(duì)凋亡的耐受是多藥耐藥的一個(gè)重要機(jī)制[1]。前期研究證實(shí),消巖湯含藥血清對(duì)A 549及A549/DDP均有生長(zhǎng)抑制作用,且能增強(qiáng)順鉑(DDP)對(duì)耐藥細(xì)胞(A 549/DDP)的殺傷作用,具有耐藥逆轉(zhuǎn)作用[2]。本研究以人肺腺癌A549和A549/DDP細(xì)胞株為受試對(duì)象,研究了消巖湯荷瘤動(dòng)物藥物血清對(duì)細(xì)胞凋亡的影響,旨在進(jìn)一步闡明消巖湯的抗耐藥機(jī)制,為其應(yīng)用于腫瘤的臨床治療提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

健康昆明種小鼠(KM)60只,SPF級(jí),雄性,4～6周齡,體質(zhì)量(20.99±1.87)g,購(gòu)自天津市山川紅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司,飼養(yǎng)設(shè)施 1級(jí),動(dòng)物質(zhì)量許可證號(hào):SCXK(津)2009-0001。

1.2 藥 物

消巖湯組成:黃芪10 g,西洋參10 g,姜黃10 g,郁金10g,蘄蛇10 g,夏枯草10 g,生牡蠣10 g,白花蛇舌草10 g。規(guī)格100mL/瓶,由本院制劑室生產(chǎn),生產(chǎn)時(shí)間 2009年 1月,批號(hào) 20090102。水煎濃縮劑制備方法參照《中藥藥物實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[3],將消巖湯于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮成每毫升相當(dāng)于原生藥材 1.5 g的藥液,冷卻裝入滅菌藥瓶,置4℃冰箱備用[3]。

1.3 瘤 株

S180(腹水瘤)瘤株,由天津藥物研究所提供。

1.4 試劑與儀器

RPMI1640培養(yǎng)基,Gibco公司產(chǎn)品;新生胎牛血清,杭州四季青生物工程公司產(chǎn)品;超凈工作臺(tái),蘇州凈化設(shè)備公司產(chǎn)品;BB5060UVCO2細(xì)胞培養(yǎng)箱,德國(guó)Heraeus公司產(chǎn)品;流式細(xì)胞儀,美國(guó)BECKMAN-COULTER公司產(chǎn)品。

1.5 細(xì)胞系

人肺腺癌細(xì)胞系 A549,由天津市藥物研究所提供;耐順鉑(DDP)肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549/DDP,購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院腫瘤研究所。

1.6 荷 S180腫瘤小鼠模型的建立

小白鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后,稱重,根據(jù)隨機(jī)數(shù)目表數(shù)列隨機(jī)分為消巖湯高劑量組、消巖湯低劑量組、模型對(duì)照組 3組,每組 20只。體外復(fù)蘇,培養(yǎng) S180細(xì)胞,在細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期收集細(xì)胞。1 500 r/min離心5 min,D-Hank's溶液洗滌2次,離心棄上清液,離心管外周以冰袋來(lái)維持溫度在4℃左右,以此來(lái)保持瘤細(xì)胞的活性。用生理鹽水稀釋,調(diào)整細(xì)胞濃度到 1×106/mL。每只小鼠右前腋下皮下接種0.2m L[4],即得。

1.7 給藥方法與劑量

小鼠于接種 S180腫瘤細(xì)胞 24 h后,高劑量組按消巖湯 40 g/kg灌胃給藥;低劑量組按消巖湯20 g/kg灌胃給藥;模型對(duì)照組以0.4m L生理鹽水灌胃。每次灌胃間隔24 h,連續(xù)10 d。

1.8 取血與藥物血清制備

末次灌胃1 h后,稱量小鼠體質(zhì)量,以眼眶取血法采血,無(wú)菌分離血清,56℃下30min滅活處理,然后用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌,置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.9 流式細(xì)胞儀Annexin V/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞A549和A549/DDP細(xì)胞,更換培養(yǎng)液,分別加入消巖湯高劑量組、消巖湯低劑量組、模型空白動(dòng)物組血清繼續(xù)培養(yǎng) 24 h。0.25%胰酶消化,A 549及A549/DDP懸浮細(xì)胞直接收集到10 mL的離心管中,每個(gè)樣本細(xì)胞數(shù)為 1×106/m L, 1 000 r/min離心5 m in,棄去培養(yǎng)液。用4℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次,1 000 r/min離心5min,棄上清液。用三蒸水按 1∶4稀釋結(jié)合緩沖液。用 4℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次,用250μL結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞,調(diào)節(jié)其濃度為 1×105/m L。用 100μL細(xì)胞懸液于5mL流式管中,加入5 m L Annexin V/ FITC和5mL PI溶液?；靹蚝笫覝乇芄夥跤?5 min。流式細(xì)胞儀激發(fā)光波長(zhǎng)為 488 nm,發(fā)射波長(zhǎng)為530 nm,Annexin V/FITC的綠色波長(zhǎng)通過(guò)FITC通道(FL1)檢測(cè);PI紅色熒光通過(guò)PI通道(FL3)檢測(cè)。

1.10 結(jié)果評(píng)價(jià)方法

左上象限PI陽(yáng)性而Annexin V陰性提示為細(xì)胞碎片,右上象限PI和Annexin V均陽(yáng)性為壞死細(xì)胞,左下象限PI和Annexin V均陰性為活細(xì)胞,右下象限PI陰性而Annexin V陽(yáng)性為凋亡細(xì)胞。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)(BZ_139_2138_999_2156_1045)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示,以一步方差A(yù)NOVA分析組間差別,并經(jīng)LSD檢驗(yàn),以P＜0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

在消巖湯藥物血清作用 A549細(xì)胞 24 h后,消巖湯低劑量組、消巖湯高劑量組細(xì)胞凋亡率分別與模型對(duì)照組比較,差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在藥物血清作用于A549/DDP 24 h后消巖湯低劑量組與模型對(duì)照組對(duì)比,細(xì)胞凋亡率差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);而消巖湯高劑量組與模型對(duì)照組對(duì)比,凋亡率差別則有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。表明消巖湯荷瘤動(dòng)物藥物血清對(duì)A 549和A549/DDP均有一定的促凋亡作用;消巖湯對(duì)順鉑誘導(dǎo)的A549/DDP耐藥細(xì)胞的凋亡具有顯著的增強(qiáng)作用;在一定范圍內(nèi),細(xì)胞凋亡率與消巖湯濃度呈正相關(guān)。見(jiàn)表1。

表1 AnnexinV/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 %,±s

表1 AnnexinV/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 %,±s

注:與模型對(duì)照組對(duì)比,*P＞0.05,**P＜0.05。

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3 討 論

腫瘤細(xì)胞對(duì)現(xiàn)有抗癌藥物的耐受是目前肺癌化療失敗的主要原因。尋找既能有效克服腫瘤細(xì)胞耐藥、毒副作用又小的抗癌藥物,是目前臨床上急需解決的問(wèn)題。研究表明,所有腫瘤細(xì)胞都存在凋亡抑制現(xiàn)象[5],細(xì)胞凋亡受抑與 MDR發(fā)生密切相關(guān)。肺癌細(xì)胞在化療藥物誘導(dǎo)條件下的耐藥表型改變都是為了抵抗藥物殺滅,保護(hù)自身生存,凋亡途徑異常與耐藥發(fā)生緊密聯(lián)系,多藥耐藥肺癌細(xì)胞的實(shí)質(zhì)是抗凋亡[6],因此采取適當(dāng)?shù)姆椒ù龠M(jìn)或誘發(fā)耐藥細(xì)胞凋亡是克服肺癌MDR的又一重要策略。

消巖湯是在“解毒祛瘀,扶正抗癌”中醫(yī)學(xué)治療腫瘤治則基礎(chǔ)上,依據(jù)現(xiàn)代藥理研究研制出的院內(nèi)制劑,具有多種抗腫瘤活性,是治療非小細(xì)胞肺癌的良好輔助用藥[7-8]。方中黃芪、西洋參滋陰益氣,扶正以驅(qū)邪;姜黃、郁金行氣解郁,活血祛瘀;伍以蘄蛇更搜剔絡(luò)脈中之瘀毒;夏枯草、生牡蠣、白花蛇舌草相伍以清熱解毒,軟堅(jiān)散結(jié)。全方祛邪而不傷正,全面調(diào)節(jié)機(jī)體的陰陽(yáng)平衡?，F(xiàn)代藥理學(xué)證明:方中單藥有不同程度的抗癌、逆轉(zhuǎn)多藥耐藥作用。姜黃素對(duì)人肺腺癌A549/DDP細(xì)胞增殖具有抑制作用,其作用機(jī)制可能是通過(guò)阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)的[9]。人參皂苷單體 Rb1具有鈣離子通道拮抗作用從而逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR[10]。

流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡的方法有多種,其中以磷脂結(jié)合蛋白Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記染色最為常用。經(jīng)前期研究證實(shí),消巖湯具有耐藥逆轉(zhuǎn)作用[2]。本研究結(jié)果提示,消巖湯能夠誘導(dǎo)發(fā)生MDR的A 549/DDP細(xì)胞發(fā)生凋亡,盡管機(jī)制不清,這仍為消巖湯對(duì)耐藥肺癌患者提供了有效的實(shí)驗(yàn)依據(jù),可為臨床提供有效的MDR逆轉(zhuǎn)措施,使肺癌患者得到更有效的治療。

[1]陳衛(wèi)強(qiáng),戚好文,吳昌歸,等.雙氫青蒿素和順鉑誘導(dǎo)人肺腺癌A549/CDDP細(xì)胞凋亡[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2007, 15(5):616-619.

[2]張瑩,賈英杰,楊潔,等.消巖湯藥物血清對(duì)A 549/DDP多藥耐藥逆轉(zhuǎn)作用的研究[J].天津中醫(yī)藥,2010,27(4): 334-336.

[3]李儀奎.中藥藥物實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1991:36.

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