巢玉彬,張惠云

(山東中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥經(jīng)典理論教育部重點實驗室,山東濟南 250355)

肝氣逆證是經(jīng)前期綜合征(PMS)的一個亞型,以煩躁易怒等情緒異常為主要臨床表現(xiàn)。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)PMS肝氣逆證發(fā)病與體內性激素周期性變化失調有關[1],動物實驗結果證實肝氣逆證大鼠下丘腦孕酮受體(PR)的活性下降[2]。為進一步明確PR在PMS發(fā)病中的作用機制,探討經(jīng)前平顆粒中樞內的作用靶點,本研究采用免疫熒光技術結合流式細胞儀、激光共聚焦顯微鏡研究了經(jīng)前平顆粒對PMS肝氣逆證模型大鼠下丘腦和頂區(qū)皮質中孕酮受體(PR)表達水平、組織內定位分布模式的影響。

1 材料與方法

1.1 動 物

雌性未孕SPF級SD大鼠30只,體質量180～ 220 g,由山東中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供,動物質量許可證號:SCXK(魯)20050015。

1.2 藥品與儀器

免疫熒光試劑盒(一抗為兔抗鼠PR多克隆抗體,二抗為山羊抗兔IgG-FITC,正常山羊封閉血清), Santa Cruz公司產(chǎn)品;L-多聚賴氨酸,上海創(chuàng)賽科學儀器有限公司產(chǎn)品;經(jīng)前平顆粒,批號 040216,江蘇揚子江藥業(yè)生產(chǎn);ST-A型數(shù)字脈沖生物刺激儀,山東中醫(yī)藥大學與濟南軍區(qū)空軍司令通信修配廠聯(lián)合研制;CT15RT臺式高速冷凍離心機,上海天美科學儀器有限公司產(chǎn)品;激光流式細胞儀(FCM,BD FACS Calibur 420),激光共聚焦顯微鏡(LSCM,Zeiss LSM 510),轉輪式切片機(LEICA RM 2015)。

1.3 模型的建立與檢測方法

1.3.1 受試大鼠篩選

實驗開始前動物預適應環(huán)境 1周,大鼠飼養(yǎng)于晝夜顛倒環(huán)境,每天21:00開燈,9:00關燈。預適應結束后,采用曠場實驗篩選得分相近大鼠進入實驗。曠場實驗方法,見 1.3.4。

1.3.2 大鼠動情周期確定

采用陰道涂片鏡檢法確定正常未孕大鼠的動情期[3]。具體步驟如下:用滴管吸取少量生理鹽水滴于大鼠陰道反復吸取 2～3次,將吸出液涂于載玻片上,使其自然風干。用無水乙醇固定2～5min,用吉姆薩染液充分附著10～30 min,沖洗,干燥,40倍顯微鏡下鏡檢。各期細胞形態(tài)見表 1。

同時大鼠動情周期評定輔助采用宏觀行為藥理學觀察方法[4]:將雌鼠引入雄鼠籠中,觀察大鼠動情行為(跳躍,奔走,搖耳,弓背,雄鼠擊打雌鼠背部)確定大鼠動情周期,同時阻止雄鼠爬跨雌鼠。大鼠動情前期/動情期(即動情周期接受期)動情行為活躍,而動情間期/動情后期(即動情周期非接受期)動情行為減退或消失,中間間隔約2 d左右。最后選取曠場得分相近、動情行為規(guī)則出現(xiàn)且活躍、處于動情周期非接受期的大鼠納入本實驗。

表1 大鼠動情周期卵巢變化及陰道涂片的組織學變化

1.3.3 分組與給藥

取處于動情周期非接受期大鼠 30只,隨機分為正常對照組、PMS肝氣逆證模型對照組、經(jīng)前平顆粒組,每組 10只。正常對照組正常飼養(yǎng),其他兩組采用電刺激法復制PMS肝氣逆證大鼠模型[5]:大鼠置入可調式激惹、噪音、脈沖電刺激籠內,設置脈沖電壓2 700～3 300 V,中等強度電流0.5 mA,脈寬0.3 s,間隔時間白天5 min,夜晚10min,連續(xù)造模5 d。經(jīng)前平顆粒組大鼠在造模同時給予經(jīng)前平顆粒灌胃給藥,劑量10 g/kg,給藥體積10μL/g,相當于人體臨床8倍劑量;PMS肝氣逆證模型對照組和正常對照組給予等體積的生理鹽水,每日9:00給藥,每日1次,連續(xù)給藥5 d。

1.3.4 曠場實驗方法[6]

100 cm×100 cm×50 cm曠場實驗箱,周壁底面為黑色,底面用白線劃分為面積相等的 25塊,沿墻的格稱為外周格,其余稱為中央格。操作者握住大鼠尾根部 1/3處,小心放入曠場正中格,用攝像系統(tǒng)記錄動物3min的行為變化。記錄得分值。①水平得分:動物穿越底面方塊數(shù)為水平活動得分(4爪均進入的方格方可記數(shù),為水平運動得分)。②垂直得分:直立次數(shù)為垂直活動得分(兩前爪騰空或攀附墻壁,為垂直運動得分)。曠場實驗總分=①+②。實驗前動物篩選和造模后模型評價各進行 1次測定。

1.3.5 免疫熒光結合流式細胞儀檢測

末次給藥后,大鼠迅速斷頭,剝離下丘腦、頂區(qū)皮質,冰上勻漿。冷生理鹽水懸浮,1 200 r/min離心洗滌8min,棄上清液,過300目篩。沉淀加入0.25%多聚甲醛溶液室溫固定1 h,后0.01 M PBS離心清洗,棄上清液。沉淀加入70%甲醇溶液4℃固定1 h,離心,棄上清液,PBS懸浮離心清洗1次。上述細胞懸液加一抗(1∶200)及0.1%Triton X-100 4℃過夜, PBS懸浮離心洗滌2次。二抗室溫孵育30 min,PBS洗滌 3次。冷生理鹽水定容,過 300目篩。用流式細胞儀檢測,Cellquest軟件處理數(shù)據(jù)和圖像。

1.3.6 免疫熒光結合激光共聚焦顯微鏡檢測

大鼠斷頭后,取下丘腦和頂區(qū)皮質,4%多聚甲醛固定,系列酒精脫水,二甲苯透明,常規(guī)石蠟包埋。切片厚度 5μm,鋪有多聚賴氨酸的玻片展片。石蠟切片脫蠟,山羊血清封閉,一抗4℃過夜,0.1M PBS (pH 7.4)沖洗。二抗37℃孵育20min,0.1 M PBS (pH 7.4)沖洗,Zeiss LSM 510激光共聚焦顯微鏡檢測,Zeiss LSM 510 Image Exam iner圖像分析軟件半定量分析相對熒光強度,受體表達量以相對熒光強度表示。

1.3.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件處理。計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)(BZ_139_2138_999_2156_1045)±標準差(s)表示,多組比較采用單因素方差分析,檢驗水準α=0.05,以P＜0.05為差別有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 造模結果

2.1.1 行為學觀察

與對照組比較,模型組大鼠活動量大,對外界刺激敏感,用電筆較易激惹,出現(xiàn)精神緊張、相互對峙、怒目而視、毛豎立、相互追逐及撕咬等現(xiàn)象;而給予經(jīng)前平顆粒預防治療組,大鼠變化不明顯。

2.1.2 曠場實驗得分對比

曠場實驗水平得分反映動物的興奮性,垂直得分反映動物對環(huán)境的適應程度,曠場實驗總分是動物探索行為及興奮性的總體反映。結果表明,較正常對照組大鼠,模型對照組大鼠水平得分、垂直得分及曠場總分均增加,垂直得分差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),說明此組大鼠活動興奮性及認知能力均有顯著性升高,結合宏觀行為學觀察初步判定模型制備成功;較模型對照組大鼠,經(jīng)前平顆粒組大鼠水平得分、垂直得分及曠場總分均顯著減少(P＜0.01,P＜0.05),說明經(jīng)前平顆粒對PMS肝氣逆證模型大鼠有明顯預防治療作用。見表 2。

表2 各組大鼠曠場實驗得分比較 分,±s

表2 各組大鼠曠場實驗得分比較 分,±s

注:與正常對照組對比,*P＜0.05;與模型對照組對比,#P＜0.05,##P＜0.01。

組 別 動物數(shù) 水平得分 豎直得分 總分正常對照組 10 26.5±14.20 8.3±2.60 38.7±25.70模型對照組 10 36.4±23.57 15.4±4.95* 43.2±32.96經(jīng)前平顆粒組 10 24.0±13.94## 6.6±1.58## 34.3±10.26#

2.2 流式細胞儀檢測結果

見圖 1,2和表 3。由圖可以看出:與正常對照組大鼠相比,模型對照大鼠下丘腦和頂區(qū)皮質中 PR蛋白均顯著降低(P＜0.05),經(jīng)前平顆粒組大鼠下丘腦和頂區(qū)皮質PR蛋白表達量較模型對照組均顯著升高(P＜0.01,P＜0.05),恢復至正常水平。

表3 流式細胞儀檢測定量統(tǒng)計結果比較分,±s

注:與正常對照組對比,*P＜0.05;與模型對照組對比,#P＜0.05,##P＜0.01。

組 別 動物數(shù) 下丘腦 頂區(qū)皮質正常對照組 10 18.5±2.42 13.3±1.69模型對照組 10 15.5±2.63* 11.2±1.60*經(jīng)前平顆粒組 10 19.5±2.94## 13.6±1.58#

2.3 激光共聚焦顯微鏡定位表達檢測結果

由圖 3,4可以看出:模型對照組大鼠下丘腦和頂區(qū)皮質神經(jīng)元PR蛋白表達的陽性細胞數(shù)顯著少于正常對照組,陽性細胞內熒光減弱。與模型對照組相比,經(jīng)前平顆粒組大鼠相同腦組織中 PR陽性細胞數(shù)增加明顯,陽性神經(jīng)元中熒光強度也明顯回升。熒光強度定量分析證實,與正常對照組相比,模型對照組大鼠下丘腦神經(jīng)元PR蛋白表達的陽性細胞數(shù)下降(P＜0.01),見表 4。在下丘腦和頂區(qū)皮質中,正常對照組大鼠PR的陽性細胞彌散分布,而模型對照組大鼠陽性細胞少而且趨向于邊緣,經(jīng)前平顆粒組大鼠細胞分布模式則趨于正常,見圖 3、圖 4。結果表明,與正常對照組相比,模型對照組和經(jīng)前平顆粒組大鼠下丘腦PR陽性神經(jīng)細胞分布模式均發(fā)生不同程度變化。

圖3 大鼠下丘腦PR定位分布免疫熒光照片 (熒光染色,×200)

圖4 大鼠頂區(qū)皮質PR定位分布免疫熒光照片 (熒光染色,×200)

表4 各組大鼠下丘腦、頂區(qū)皮質相對熒光強度對比 分,±s

表4 各組大鼠下丘腦、頂區(qū)皮質相對熒光強度對比 分,±s

注:與正常對照組比較,**P＜0.01。

組 別 動物數(shù) 下丘腦 頂區(qū)皮質正常對照組 10 1 153.7±58.78 584.3±45.16模型對照組 10 1 020.4±84.37** 552.8±37.14經(jīng)前平顆粒組 10 1 082.2±94.62 558.9±30.41

3 討 論

PMS發(fā)病機制復雜,可能是多因素作用的結果,具體病因尚不清楚[7]。不過已有證據(jù)顯示,PMS軀體和心理癥狀與精神因素、體液潴留、催乳素(PRL)排出增多、雌激素/孕激素(P)比例失常及β-內啡肽、5-羥色胺(5-HT)、γ-氨基丁酸(GABA)、腎上腺素(E)能神經(jīng)系統(tǒng)等有關[8]。體內孕酮的變化不僅可以影響下丘腦體溫調節(jié)中樞[9],還與調節(jié)情緒和行為的5-HT能、NE能、GABA能系統(tǒng)及單胺氧化酶密切相關[10-12]。孕酮發(fā)揮調節(jié)情緒和行為的作用要通過孕酮受體介導,其中樞內受體結合位點分布于視前區(qū)、室旁核、下丘腦前部、腹內側核、弓狀核和正中隆起,另外內側基底下丘腦也包含重要的孕酮受體神經(jīng)元[13]。Wolfe CA等[14]研究結果表明,PR在大鼠下丘腦和邊緣葉的表達量及分布模式不僅具有性別差異,而且隨月經(jīng)周期變化而變化。

經(jīng)前平顆粒主要有白芍、香附、川楝子(炒)、柴胡、川芎、枳殼、豆蔻、半夏(姜制)、木香、甘草組成,專為治療經(jīng)前期緊張綜合征肝氣逆證而研制,具有平肝理氣、除脹止痛,佐以和胃之功效。臨床研究證明,經(jīng)前平顆粒治療PMS可能與調節(jié)患者血清/尿液E2、P、PRL、5-HT、E和NE紊亂有關[15-16];實驗研究顯示,除前述遞質和激素外,經(jīng)前平顆粒還可調控受試動物血清一氧化氮(NO)及超氧化物歧化酶(SOD)等[17-19],對中樞 5-HT、DA等單胺類神經(jīng)遞質[20]、內嗎啡肽[21]和雌激素受體[22]等與 PMS密切相關物質的失調也具有顯著糾正作用,但對中樞 PR與PMS肝氣逆證關系的研究和報道則相對欠缺。

本實驗采用電刺激造模方法復制PMS肝氣逆證動物模型,曠場實驗結果結合宏觀行為學觀察初步判定模型制備是成功的;免疫熒光技術結合流式細胞儀、激光共聚焦顯微鏡研究證實經(jīng)前平顆粒能夠顯著上調 PMS肝氣逆證大鼠下丘腦和頂區(qū)皮質PR表達水平,恢復其中 PR陽性細胞正常分布模式的趨勢明顯。上述發(fā)現(xiàn)表明,PMS肝氣逆證發(fā)病與中樞PR密切相關,下丘腦和頂區(qū)皮質中PR可能是經(jīng)前平顆粒的重要作用靶位,這也為進一步研究該病證中樞發(fā)病機制及新藥研發(fā)提供了部分依據(jù)。

[1]魏霞,張惠云,喬明琦.經(jīng)前平顆粒對經(jīng)前期綜合征肝氣逆證患者血清 E2、P峰值的影響[J].山東中醫(yī)藥大學學報,2006,30(3):198-200.

[2]馬月香,喬明琦,張惠云.大鼠模擬經(jīng)前期綜合征肝氣逆證不同腦區(qū)E2受體、P受體基因表達mRNA水平變化[J].世界科學技術:中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2008,10(1):68-71.

[3]陳奇.中藥藥理研究方法學[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1993:83.

[4]Hoi-Por Ho,Marie Olsson,Lars Westberg,et al.The serotonine Reuptake Inhibitor Fluoxetine Reduces Sex Steriod-Related Aggresson in Female Rats:An animalModelof p remenstrual Irritability?[J].Neuropsychopharmacology,2001,24 (5):502-510.

[5]魏盛.經(jīng)前期綜合征肝氣逆、肝氣郁證動物模型改進及肝失疏泄微觀機制研究[J].山東中醫(yī)藥大學學報, 2007,31(5):125.

[6]劉曉偉,張紅梅,曲宏達,等.“怒傷氣”大鼠行為觀察與檢測[J].江蘇中醫(yī)藥,2005,26(3):53-55.

[7]LoriM Dickerson,Pamela JMazyck,Melissa H Hunter.Premenstrual Syndrome[J].American fam ily physiclan,2003, 67(8):1743.

[8]喬明琦,張惠云.中醫(yī)情致學[M].北京,人民衛(wèi)生出版社,2009:326-328.

[9]Barton D,Loprinzi C,Wahner-Roedler D.Hot flashes:aetiologyand management[J].Drugs Aging,2001,18:597-606.

[10]Berendsen HHG.The role of serotonin in hot flushes[J]. Maturitas,2000,36:155-164.

[11]Kaura V,Ingram CD,Gartside SE,et al.The progesterone metabolite allopregnanolone potentiates GABA(A) receptor-mediated inhibition of 5-HT neuronalactivity[J]. Eur Neuropsychopharmacol,2007,17:108-115.

[12]Gundlah C,Lu NZ,Bethea CL.Ovarian steroid regu lation ofmonoam ine oxidase-A and-BmRNAs in themacaque dorsal raphe and hypothalamic nuclei[J].Psychopharmacology,2002,160:271-282.

[13]B Liu,L A Arbogast.Gene Expression Profiles of Intracellular and Membrane Progesterone Recep tor Isoforms in the Mediobasal Hypothalamus during Pro-oestrus[J].Neuroendocrinol,2009,21(12):993-1000.

[14]Wolfe CA,Van Doren M,Walker HJ,etal.Sex differences in the location of immunochemically defined cell populations in the mouse p reoptic area/anterior hypothalamus[J].Brain Res Dev Brain Res,2005,157(1):34-41.

[15]孫曉玲,許麗綿,羅頌平,等.經(jīng)前平顆粒對經(jīng)前期綜合征肝氣逆證患者的神經(jīng)內分泌調節(jié)[J].時珍國醫(yī)國藥,2010,21(4):840-842.

[16]喬明琦,張惠云,高冬梅.經(jīng)前平顆粒對經(jīng)前期綜合征肝氣逆證患者尿中神經(jīng)遞質變化的影響[J].遼寧中醫(yī)雜志,2007,34(3):257-259.

[17]張惠云,喬明琦,朱武成,等.大鼠模擬經(jīng)前期綜合征肝氣逆證血清激素與行為變化[J].中成藥,2002,24(2): 118-119.

[18]鄭春梅,張惠云.大鼠血清中單胺類遞質的高效液相色譜—熒光檢測法分析[J].藥物分析雜志,2006,26 (2):215-217.

[19]周繼發(fā),朱萱萱,顧和亞,等.經(jīng)前平顆粒對老齡和去勢大鼠激素水平的實驗研究[J].實用中醫(yī)內科雜志, 2008,22(5):67-69.

[20]徐明婧,張惠云.經(jīng)前平顆粒治療經(jīng)前期綜合征肝氣逆證大鼠的作用機制[J].藥學與臨床研究,2010,18(2): 152-155.

[21]馬晶,張惠云.經(jīng)前期綜合征模型大鼠下丘腦和外周血內嗎啡肽含量變化的實驗研究[J].藥學與臨床研究, 2008,16(5):343-346.

[22]耿燕楠,張惠云.經(jīng)前期綜合征肝氣逆證模型大鼠腦雌激素α受體蛋白水平的表達[J].中藥新藥與臨床藥理,2010,21(5):490-492.