裴 勇

(河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部,河南鄭州 450000)

消炎止痛洗劑為本院制劑,主要由土茯苓、大黃、芒硝等中藥組成,具有清熱祛濕、消腫止痛的作用,用于治療陽證瘡瘍、便下膿血、痔瘺術(shù)后疼痛。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法對(duì)消炎止痛洗劑中的蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果表明,該方法簡(jiǎn)便可靠,重復(fù)性好,可以為質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 試藥與儀器

消炎止痛洗劑由本院制劑室提供,批準(zhǔn)文號(hào)為河南省食品藥品監(jiān)督管理局制劑注冊(cè)批件第2005Z01805號(hào),批號(hào)分別 為 100308,100323, 100512。甲醇為色譜純,水為純凈水。蘆薈大黃素對(duì)照品批號(hào)為110795-200504、大黃酸對(duì)照品批號(hào)為110757-200206、大黃素對(duì)照品批號(hào)為110756-200110、大黃酚對(duì)照品批號(hào)為 110796-200513、大黃素甲醚對(duì)照品批號(hào)為 110758-200610,均購自中國(guó)藥物制品檢定所。

戴安Ultimate 3000高效液相色譜儀(配Chromeleon工作站,紫外檢測(cè)器),色譜柱為Alltima C18(250mm×4.6mm,5μm)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Alltima C18(250 mm×4.6 mm, 5μm),流動(dòng)相為甲醇∶0.1%磷酸(85∶15),流速1.0m L/min,檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm[1],柱溫30℃,進(jìn)樣量:對(duì)照品10μL、樣品20μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備

精密量取樣品5.0mL,加入8%鹽酸10mL,超聲5min;再加入三氯甲烷15 m L,加熱回流1 h,放冷,置分液漏斗中;用少量三氯甲烷洗滌容器,并入分液漏斗中,分取三氯甲烷層;酸液再用三氯甲烷提取3次,每次15m L;合并三氯甲烷液,減壓回收溶劑至干;殘?jiān)蛹状际蛊淙芙?轉(zhuǎn)移至10m L容量瓶中;加甲醇至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得[1]。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚 5種對(duì)照品適量,加甲醇分別制成每毫升含蘆薈大黃素101.6μg、大黃酸79.6μg、大黃素80.8μg、大黃酚 82μg、大黃素甲醚 40μg的對(duì)照品儲(chǔ)備液;分別精密量取上述對(duì)照品溶液各 2mL,混勻,即得混合對(duì)照品溶液Ⅰ(每毫升中含蘆薈大黃素20.32μg、大黃酸15.92μg、大黃素16.16μg、大黃酚16.40μg、大黃素甲醚8.0μg)。

分別取蘆薈大黃素對(duì)照品儲(chǔ)備溶液 1.5 m L、大黃酸對(duì)照品溶液(濃度為0.496 3 g/L)1.0mL、大黃素對(duì)照品儲(chǔ)備溶液1.0m L、大黃酚對(duì)照品儲(chǔ)備溶液2.5 mL、大黃素甲醚對(duì)照品儲(chǔ)備溶液1.0 mL,置10 mL容量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,即得混合對(duì)照品溶液Ⅱ。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備

依處方比例稱取除大黃以外的其余藥材,采用消炎止痛洗劑制備工藝制備,按“2.2”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。將供試品溶液、陰性對(duì)照溶液以及混合對(duì)照品溶液Ⅰ,分別注入高效液相色譜儀,按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果,陰性無干擾,見圖1。

圖1 混合對(duì)照品Ⅰ、供試品和陰性對(duì)照溶液的HPLC色譜圖

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取供試品溶液,在上述色譜條件下進(jìn)樣分析,蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚與相鄰色譜峰的分離度均大于 1.5。理論塔板數(shù)按大黃素計(jì)算不低于 3 000。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取上述混合對(duì)照品溶液Ⅰ1.0,5.0, 10.0,15.0,20.0μL,按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以進(jìn)樣量(μL)為橫坐標(biāo),峰面積積分值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程分別為蘆薈大黃素 Y= 1.631 4X-0.193 4(r=0.999 9),大黃酸Y=1.078 2 X-0.1716(r=0.999 9),大黃素Y=1.231 5X-0.159 4 (r=0.999 9),大黃酚Y=1.366 3X-0.192 2(r= 0.999 9),大黃素甲醚Y=0.429 8X-0.060 8(r= 0.999 9)。結(jié)果表明,蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚進(jìn)樣量分別在 0.020～0.406μg、0.016～0.318μg、0.016 2～0.323 0μg、0.016 4～0.328 0μg、0.008～0.160μg范圍內(nèi)時(shí),進(jìn)樣量與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液Ⅰ,按上述色譜條件,重復(fù)進(jìn)樣 5次,計(jì)算蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚色譜峰面積的RSD分別為為0.56%、0.85%、0.95%、0.18%、0.32%。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)的樣品,按“2.2.2”項(xiàng)方法平行制備 5份樣品按上述色譜條件進(jìn)樣分析,計(jì)算蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含量的RSD,分別為 1.35%,0.93%、1.01%、0.98%、1.14%(n=5)。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液,分別于 0,2,4,6,8,12 h注入高效液相色譜儀,依法測(cè)定。計(jì)算蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚色譜峰面積的RSD,分別為1.27%、0.89%、1.03%、0.99%、1.22%(n= 6)。結(jié)果表明,樣品溶液在 12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的供試品3.0 m L(批號(hào)100512) 6份,分別加入混合對(duì)照品溶液Ⅱ1m L,按上述方法測(cè)定分析,結(jié)果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚平均回收率分別為 100.34%、99.57%、99.75%、97.24%、98.50%,RSD分別為1.77%、0.64%、0.81%、1.89%、1.91%(n=6)。分別見表 1、表 2、表 3、表 4、表 5。

表1 蘆薈大黃素加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2 大黃酸加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表3 大黃酚加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表4 大黃素加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表5 大黃素甲醚加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品含量測(cè)定

取 3批供試品,按“2.2.2”項(xiàng)操作,在上述條件下進(jìn)樣分析,記錄色譜峰面積,采用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量。結(jié)果見表 6。

表6 樣品含量測(cè)定結(jié)果 n=3,mg/m L

3 討 論

實(shí)驗(yàn)色譜條件采用藥典方法[2],蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚即達(dá)到較好的分離效果,且重復(fù)性好。由于樣品中蒽醌類成分含量較低,為了減少處理樣品時(shí)有機(jī)溶劑的用量并達(dá)到較高的提取率,取樣量定為 5m L時(shí),供試品中待測(cè)成分含量較低,所以進(jìn)樣量選擇 20μL。

測(cè)定結(jié)果,5種成分中大黃酸遠(yuǎn)比其他成分含量高。實(shí)驗(yàn)前曾考察到該制劑中游離蒽醌類成分的含量,結(jié)果,除大黃酸外,其他 4種成分幾乎檢測(cè)不到,這主要與大黃中的 5種游離蒽醌類成分的理化性質(zhì)有關(guān)。游離蒽醌類成分一般不溶于水,而大黃酸可能是因?yàn)樗嵝暂^強(qiáng),和某些堿性成分中和成鹽而增大了溶解度。

[1]凌明,朱克,王宜祥.高效液相色譜法測(cè)定五參安神合劑中大黃素含量[J].中國(guó)藥業(yè),2008,17(22):37-38.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:一部[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2010:22.