任雪琴,任曉慧,吳 兵,張長(zhǎng)春,陳 新

(武漢工業(yè)學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院,湖北武漢 430023)

三萜化合物是以六分子異戊二烯為單位的聚合體。由于三萜化合物生物活性的多樣性及重要性,近年來成為中藥化學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)領(lǐng)域,而加之現(xiàn)代分離鑒定手段先進(jìn),NMR技術(shù)的應(yīng)用,大大加快了三萜化合物的研究進(jìn)展。

據(jù)三萜化合物在生物體內(nèi)的存在形式、結(jié)構(gòu)和性質(zhì),可分為兩大類：三萜皂苷及其苷元、其他三萜類 (包括樹脂、苦味素、三萜生物堿及三萜醇等)。但一般則根據(jù)三萜類化合物碳環(huán)的有無和多少進(jìn)行分類。目前已發(fā)現(xiàn)的三萜類化合物,多數(shù)為四環(huán)三萜和五環(huán)三萜,少數(shù)為鏈狀、單環(huán)、雙環(huán)和三環(huán)三萜。近幾十年來還發(fā)現(xiàn)了許多由于氧化、環(huán)裂解、甲基轉(zhuǎn)位、重排及降解等而產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)復(fù)雜的高度氧化的新骨架類型的三萜類化合物。

1 三萜化合物的生理活性

三萜化合物的生理活性：三萜類化合物具有廣泛的生理活性。通過對(duì)三萜類化合物的生物活性及毒性研究結(jié)果顯示,其具有溶血、抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒、降低膽固醇、殺軟體動(dòng)物、抗生育等活性。如烏蘇酸是夏枯草的抗癌活性成分,雪膽甲素是山苦瓜的抗癌活性成分。

1.1 抗腫瘤活性

三萜化合物具有廣泛抗腫瘤生物活性,在自然界中的分布廣泛。其中具有顯著抗腫瘤活性的主要包括四環(huán)三萜和五環(huán)三萜。其作用機(jī)制主要通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤細(xì)胞增殖、抑制腫瘤新生血管生成和在線粒體以及基因水平發(fā)揮抗腫瘤活性。同時(shí),該類化合物具有明顯的抗癌藥物協(xié)同作用[1]。

三萜類化合物對(duì)多種癌細(xì)胞株有抗癌活性,抗癌活性較強(qiáng)的有達(dá)瑪烷型四環(huán)三萜人參皂苷 Rg3、Rh2和原人參二醇,羽扇豆烷型五環(huán)三萜白樺脂酸,木栓烷型五環(huán)三萜南蛇藤素和扁蒴藤素[1]。人參皂苷 Rg3、Rh2與環(huán)磷酰胺聯(lián)合用藥能增強(qiáng)環(huán)磷酰胺的抗腫瘤活性,同時(shí)降低其毒副反應(yīng)。人參皂苷Rg3與環(huán)磷酰胺聯(lián)合用藥具有抗血管生成協(xié)同作用,抑制腫瘤生長(zhǎng)效果顯著,此外還能降低機(jī)體耐藥系統(tǒng)的敏感性。Rg3與三氧化二砷聯(lián)合用藥對(duì)抑制移植瘤肝癌細(xì)胞增殖有協(xié)同作用,因?yàn)?Rg3抑制腫瘤生長(zhǎng)主要是通過抑制腫瘤血管生成,而三氧化二砷對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用是通過抑制 PCNA蛋白的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。Rg3聯(lián)合 5-FU誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡作用比單用 Rg3或 5-FU明顯。葫蘆素 B與多西他奇聯(lián)合用藥對(duì)誘導(dǎo) Hep-2細(xì)胞凋亡沒有協(xié)同作用?？傊?三萜類化合物在腫瘤的治療與預(yù)防領(lǐng)域具有較好的開發(fā)和應(yīng)用前景。

1.2 抗 HIV活性

白樺脂酸 (betulinic acid,BA)最早分離自生長(zhǎng)于非洲東部的鼠李科常綠植物 Ziziphusm auritiana Lam.的樹皮[2],屬于五環(huán)三萜類化合物。1994年T.Fujioka等首次發(fā)現(xiàn)了 BA的抗 HIV活性[3]。隨后,有關(guān) BA及其衍生物的抗 HIV活性引起人們極大關(guān)注。

大量研究表明,BA類化合物抗 HIV作用是通過阻止 HIV進(jìn)入宿主細(xì)胞和阻止 HIV在宿主細(xì)胞中的成熟兩個(gè)途徑實(shí)現(xiàn),完全不同于目前臨床抗HIV藥物通過作用于病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶 (RT)和蛋白酶(PR)這兩個(gè)靶點(diǎn)的作用機(jī)理,對(duì)解決目前臨床抗HIV藥物引發(fā)的耐藥性和副作用這一關(guān)鍵問題提供思路,并為新型抗 HIV藥物開發(fā)帶來了新的希望[4]。

皂角刺中含有豐富的白樺脂酸型三萜,其中有些顯示出強(qiáng)烈的抗 HIV活性,這對(duì)抗 HIV新藥開發(fā)和皂角刺新的藥用功效開發(fā)有重要實(shí)用價(jià)值。通過化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)與藥理活性之間的關(guān)系考察發(fā)現(xiàn),白樺脂酸型三萜類化合物分子中 C3位-OH上苯丙稀酸類基團(tuán)取代會(huì)導(dǎo)致其抗 HIV活性大幅度下降,這對(duì)該類化合物的作用機(jī)理研究及分子修飾和結(jié)構(gòu)改造有重要的參考意義[5]。

1.3 抗抑郁活性

積雪草的有效成分積雪草三萜皂苷具有明顯的抗抑郁作用。秦路平、陳瑤、鄭漢臣[6]等人通過強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)和未預(yù)知的長(zhǎng)期溫和應(yīng)激刺激試驗(yàn)對(duì)積雪草三萜總苷的抗抑郁作用進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)積雪草三萜總苷能明顯地縮短強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間、改變大鼠的抑郁行為、防止抑郁大鼠大腦皮層和海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和形態(tài)的變化以及神經(jīng)內(nèi)分泌的紊亂,顯示出較好的抗郁作用。

1.4 抗衰老活性

大豆皂苷是一類由齊墩果烷型三萜苷元與低聚糖鏈接而成的三萜皂苷,具有多種藥理活性,其中大豆皂苷抗衰老作用尤為明顯。大豆皂苷在一定程度上促進(jìn)細(xì)胞超氧化岐化酶 (SOD)的合成,從而使細(xì)胞增加抗自由基能力,延緩衰老過程。高學(xué)敏[7]等人從人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn),大豆皂苷由于能調(diào)整細(xì)胞內(nèi)環(huán)腺苷酸含量,從而提高DNA修復(fù)功能,增加細(xì)胞抵抗不良環(huán)境的能力。

1.5 其他生物活性

三萜化合物除了以上主要的幾種生物活性外,還具有其它生物活性。枇杷三萜酸主要含熊果酸和齊墩果酸,三萜酸具有減肥、降血糖、抗肝損傷、抗菌消炎和抗病毒等多種生物學(xué)活性[8]。羅艷等人[9]研究發(fā)現(xiàn)吉林地榆中的三萜皂苷類成分具有良好的抗炎活性。姜北等人[10]篩選研究發(fā)現(xiàn),腺花香茶菜中的三萜化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞具有一定的細(xì)胞毒活性。

2 幾種天然三萜化合物的 NMR研究進(jìn)展

2.1 NMR原理及解譜方法

核磁共振波譜是以兆周 (10-1-102MHz)數(shù)量級(jí)的電磁波作用于原子核,原子核產(chǎn)生自旋躍進(jìn)所得的吸收譜。核磁共振現(xiàn)象來源于原子核的自旋角動(dòng)量在外加磁場(chǎng)作用下的進(jìn)動(dòng)。一般根據(jù)化學(xué)位移鑒定基團(tuán);由耦合分裂峰數(shù)、偶合常數(shù)確定基團(tuán)聯(lián)結(jié)關(guān)系;根據(jù)各 H峰積分面積定出各基團(tuán)質(zhì)子比。核磁共振譜可用于化學(xué)動(dòng)力學(xué)方面的研究,如分子內(nèi)旋轉(zhuǎn),化學(xué)交換等,因?yàn)樗鼈兌加绊懞送饣瘜W(xué)環(huán)境的狀況,從而譜圖上都應(yīng)有所反映。核磁共振還用于研究聚合反應(yīng)機(jī)理和高聚物序列結(jié)構(gòu)。

H譜、C譜是應(yīng)用量廣泛的一維核磁共振譜,較常用的還有 F、P、N等核磁共振譜。核磁共振適合于液體、固體。如今的高分辨技術(shù),還將核磁用于了半固體及微量樣品的研究。核磁譜圖已經(jīng)從過去的一維譜圖 (1D)發(fā)展到如今的二維 (2D)、三維 (3D)甚至四維 (4D)譜圖,陳舊的實(shí)驗(yàn)方法被放棄,新的實(shí)驗(yàn)方法迅速發(fā)展,它們將分子結(jié)構(gòu)和分子間的關(guān)系表現(xiàn)得更加清晰。

所以在這些理論基礎(chǔ)上新的化合物不斷地被發(fā)現(xiàn),人們?cè)谌苹衔锏难芯可弦苍诓粩嗟呐Α?/p>

2.2 新型靈芝三萜類化合物13 CNMR的譜學(xué)特征

13CNMR中最易分辨的信號(hào)是烯碳原子,當(dāng)雙鍵位于不同類型母核或同一母核的不同位置時(shí),其碳原子化學(xué)位移有明顯差別。13CNMR除用于確定骨架外,對(duì)于解決某些立體化學(xué)問題也很有幫助。

靈芝三萜類化合物屬于高度氧化的羊毛甾烷或降羊毛甾烷類衍生物,按所含碳原子數(shù)目可分為C30、C27和 C24主要三大類型;在近 l0余年發(fā)現(xiàn)的靈芝三萜化合物中,有不少具有變型的化學(xué)結(jié)構(gòu),A環(huán)開環(huán)的就是比較典型的例子。

靈芝三萜類化合物母核上 C3、C7、C12、C15的取代基不同時(shí),對(duì)其相鄰碳的化學(xué)位移有較大影響。C3連有羰基時(shí) ,Cl、C2、C4的化學(xué)位移分別為 δC35～37(t),δC34～35(t),δC46～47(s);C3連有羥基時(shí) ,此 3個(gè)碳的化學(xué)位移均向高場(chǎng)位移,其化學(xué)位移分別為δC33～34(t),δC26～27(t),δC37～38(s)。C7連有羰基時(shí) ,C6δC33～37(t);C3連有羥基時(shí) ,C6δC26～28(t)。C15連有羰基時(shí) ,C14δC57～59(s);C15連有羥基時(shí) ,C14δC52～53(t)[11]。

確定相對(duì)構(gòu)型時(shí),可根據(jù)1H NMR的化學(xué)位移變化來確定。當(dāng) C3、C7、C12、C15連有羥基時(shí) ,隨著羥基構(gòu)型的不同,該羥基偕氫的化學(xué)位移和偶合常數(shù)也會(huì)有相應(yīng)的改變。

靈芝三萜化合物中,出現(xiàn)的雙鍵較多,各種位置都會(huì)出現(xiàn)烯鍵,A環(huán)、B環(huán)上的雙鍵多出現(xiàn)在 C7-C8,C8-C9,C9-C11和側(cè)鏈上雙鍵出現(xiàn)在 C24-C25,C20-C22的較多。在烯鍵處于 C7-C8和 C9-C11這類化合物中,C7一般出現(xiàn)在δC120—121(d),C8一般出現(xiàn)在δC140—142(s),C9一般出現(xiàn)在 δC141—145(s),C11一般出現(xiàn)在δC115—117(d)。從烯鍵的13CNMR化學(xué)位移,推測(cè)靈芝三萜中的雙鍵位置,變得十分簡(jiǎn)單。側(cè)鏈上的雙鍵位置有 C20-C22和 C24-C25兩類,在 C20-C22這類化臺(tái)物中,C20一般位于δC154—157(s),而C22基本上出現(xiàn)在 δC124.3—124.7(d),后者 C24則出現(xiàn)在δC139—145(d),C25出現(xiàn)在δC126—129(s),側(cè)鏈上雙鍵位置的13CNMR數(shù)據(jù)十分特征,很容易判斷烯鍵所在的位置。

2.3 夏枯草屬植物三萜類化合物13 CNMR的譜學(xué)特征

查閱國(guó)內(nèi)外研究文獻(xiàn),對(duì)夏枯草屬植物中三萜類成分進(jìn)行總結(jié),并對(duì)其13CNMR波譜特征進(jìn)行歸納、分析。夏枯草屬植物中含有多種三萜化合物,主要為齊墩果烷型、烏蘇烷型和羽扇豆烷型三萜。迄今分離得到幾十個(gè)三萜化合物,皂苷的糖鏈多數(shù)連接在 28位,較少連接在 3位或者其它位,而 28位糖鏈也只是由 1個(gè)或 2個(gè)單糖所組成[12]環(huán)三萜化合物類型較多,核磁共振波譜較為復(fù)雜,這里僅就常見的齊墩果烷型和烏蘇烷型五環(huán)三萜的部分13CNMR波譜特征加以總結(jié)。

2.3.1 齊墩果-12-烯和烏蘇-12-烯的骨架特征

這兩類不同骨架化合物最明顯的特征表現(xiàn)為C12,C13的化學(xué)位移不同。在齊墩果-12-烯結(jié)構(gòu)中,C12,C13分別為 δC125,δC145,而烏蘇 -12-烯中 ,C-12,13分別為δC125,δC139,略有差異。當(dāng)結(jié)構(gòu)中 27位上有-COOH或-CH2OH時(shí),C12δC向低場(chǎng)移動(dòng)約 1—8,同時(shí) C13δC向高場(chǎng)移動(dòng)約 5—7,當(dāng)齊墩果 -12-烯有19-OH取代也產(chǎn)生相似效應(yīng)。兩類結(jié)構(gòu)的另一個(gè)特征是烏蘇-12—烯有比齊墩果-12-烯比化學(xué)位移大50的 C信號(hào) ,即其 C19位有 CH3取代基 ,烏蘇-12-烯的 C18信號(hào)比齊墩果-12-烯 (無 19位-OH取代)向低場(chǎng)位移約 10以上。另外,18α-H也影響了 C12,C13的化學(xué)位移值。

2.3.2 羥基取代效應(yīng)對(duì)三萜化合物的13CNMR的影響

對(duì)各種類型單羥基或多羥基取代三萜的13CNMR數(shù)據(jù)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),羥基取代可引起α-C,β-C分別向低場(chǎng)移動(dòng) 34～50,2～10,而γ-C則向高場(chǎng)移動(dòng) 0～9。

2.3.3 羥基位置和構(gòu)型對(duì)三萜化合物的13CNMR的影響

在齊墩果-12-烯結(jié)構(gòu)中,與 C29,C30位羧基或甲基取代時(shí),C19,C21化學(xué)位移值向高場(chǎng)移動(dòng) 4—6;C20向低場(chǎng)移動(dòng),若被羧基取代,移動(dòng)約為 13,若被羥甲基取代則移動(dòng)約為 5,此時(shí) C20連接的甲基碳的化學(xué)位移值向高場(chǎng)位移約 4—5。

C23有-CH2OH(e鍵)化學(xué)位移值約為 68,比 24-CH2OH(約為 64)總處于低場(chǎng);和 23,24-CH3比較,當(dāng)有 23-CH2OH取代時(shí),使 C-4向低場(chǎng)位移約 4,C-3,C-5和 C-24(CH3)向高場(chǎng)位移約 4和 2.4。當(dāng)有24-CH2OH取代時(shí),也使 C-4的化學(xué)位移值向低場(chǎng)位移約 4,C-23(CH3)向高場(chǎng)位移約 4.5,但對(duì) C-3和 C-5影響較小。

3β-OH取代與相應(yīng)的 3α-OH取代的化合物比較,C-5的化學(xué)位移向高場(chǎng)位移 4.2～7.2,C-24向低場(chǎng)位移 1.2～6.6。當(dāng) 2位有羥基取代時(shí),C-2的化學(xué)位移值總是比 C-3(78.2～83.8)處于高場(chǎng),從而使 C-1的化學(xué)位移向低場(chǎng)位移約 5～10。

三萜化合物 C-16,C-19和 C-15,C-18分別具有16α-OH和 16β-OH構(gòu)型,兩者的不同很容易從 C-16的化學(xué)位移上看出來。具有 16α-OH的 C-16化學(xué)位移 (74.0)比其具有 16β-OH構(gòu)型的異構(gòu)體的 C-16化學(xué)位移 (67.5)向低場(chǎng)移動(dòng)約 5.5。

2.4 其它天然三萜化合物的NMR研究進(jìn)展

王英等人[13]從亮葉楊桐中分離得到 6個(gè)三萜皂苷化合物,通過波譜和化學(xué)方法鑒定了它們的結(jié)構(gòu),其中 1個(gè)為新化合物,另外 5個(gè)為首次從亮葉楊桐中分離得到。亮葉楊桐葉在廣西民間被作為代茶飲料已有悠久歷史了,其葉有較明顯的消炎、解毒、止血和降壓功效[14]。民間還常用以治療腮腺炎、痢疾和高血壓等[15]。

張翠仙等人[16]從嶺南地區(qū)的毛冬青根中分離得到 2個(gè)三萜類化合物,經(jīng)理化及波譜方法鑒定了其結(jié)構(gòu),并且首次利用 2D NMR技術(shù)對(duì)此 2個(gè)化合物的1H NMR和13CNMR數(shù)據(jù)進(jìn)行了全歸屬。前期藥理學(xué)活性表明毛冬青總?cè)圃碥站哂忻黠@降低血漿粘度的作用。

劉玥輝等人[17]應(yīng)用 2D NMR技術(shù),首次對(duì)蒙古黃芪中環(huán)阿屯烷型四環(huán)三萜代表性化合物黃芪甲苷的1H NMR和13CNMR信號(hào)進(jìn)行了準(zhǔn)確歸屬,對(duì)其他 6個(gè)環(huán)阿屯烷型皂苷的13CNMR信號(hào)進(jìn)行準(zhǔn)確歸屬,結(jié)果確定了其相對(duì)構(gòu)型。

歐陽明安[18]從滿樹星中分離出一種 18,19-裂烏索酸型三萜皂苷-滿樹星苷 Ⅰ,經(jīng)1H NMR,13CNMR,DEPT,1H-1H COSY,HMBC,HMQC和NOESY譜鑒定,確定了該化合物的碳骨架結(jié)構(gòu),并且對(duì)該化合物的NMR信號(hào)進(jìn)行了全歸屬。

張慧等人[19]從中藥烏骨藤中分離得到 4種五環(huán)三萜單體化合物,分別為β-香樹脂醇、白樺酯醇、白樺酯酸和羽扇豆醇,并且利用核磁共振譜、質(zhì)譜、紅外光譜等分析手段鑒定這 4個(gè)化合物,其中后 3個(gè)化合物具有抗腫瘤活性[20]。

同樣,楊光忠等人[21]從雷公藤根心部分分離得到一個(gè)純的三萜化合物,經(jīng)過光譜分析 (HPE IMS,1H NMR,13CNMR,HMBC,HMQC,NOESY)鑒定其結(jié)構(gòu)為 3β,22β-dihydroxy-29-nor-D：A-friedoolean-21-one-2β,24-lactone,經(jīng)過比對(duì)此化合物為一個(gè)新的三萜化合物。

3 結(jié)束語

三萜化合物具有多種生物活性,其結(jié)構(gòu)也比較復(fù)雜,給鑒定工作帶來了一定難度。至今,仍然有很多新型三萜化合物被不斷發(fā)現(xiàn),利用 NMR化學(xué)位移數(shù)據(jù)分析,確定有活性的三萜化合物的結(jié)構(gòu)是很有意義的。但是,僅僅利用 NMR技術(shù)是很難確定三萜化合物結(jié)構(gòu)的,然而,聯(lián)合化學(xué)方法、質(zhì)譜和NMR技術(shù)會(huì)使三萜化合物的結(jié)構(gòu)明晰化,將經(jīng)典方法與現(xiàn)代儀器分析手段結(jié)合使用,綜合互補(bǔ),才能更清晰地解析三萜皂苷化合物的正確結(jié)構(gòu)。

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