栗永茂 (長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,湖北荊州434025)

曹勝波 (華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,湖北武漢430070)

王明蛟 (廣州雨潤(rùn)肉類食品有限公司,廣東廣州51 0935)

霍雨艷,熊 濤,吳光旭 (長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,湖北荊州434025)

乙型腦炎病毒 (Japanese encephalitis virus,JEV)又稱日本腦炎病毒,是一種有包膜的單股正鏈RNA病毒。由其引起的乙型腦炎主要在東南亞的一些地區(qū)和國(guó)家流行,其中我國(guó)是高發(fā)區(qū)。亞洲每年約有乙腦病例5萬(wàn)多人,其中約有萬(wàn)人被致死,因此流行性乙型腦炎是亞洲公共衛(wèi)生的重要問(wèn)題之一。同時(shí),乙腦也是豬的重大疫病之一,其暴發(fā)常給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。而目前對(duì)乙腦沒有特效的治療方法,所以用疫苗預(yù)防和控制該病的發(fā)生顯得尤為重要。因此尋求高效、安全及新型的乙腦疫苗,已經(jīng)成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。

1 JEV分子生物學(xué)特點(diǎn)

JEV的基因組長(zhǎng)約11 kb,含單一的開放讀碼框,依次編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白 (C、M和E)和7種非結(jié)構(gòu)蛋白 (NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)[1]。

C蛋白與基因組RNA構(gòu)成病毒的核衣殼,對(duì)病毒有一定保護(hù)作用。膜蛋白M與病毒的裝配、成熟有關(guān)。Takegami等 (1982)對(duì)其生物學(xué)功能進(jìn)行了研究,認(rèn)為M蛋白參與病毒的感染過(guò)程,是病毒誘發(fā)保護(hù)性免疫的重要協(xié)同成分,而且還能誘生具有輕度中和作用的抗體。E蛋白是與細(xì)胞膜受體相結(jié)合,與病毒的致病性、誘導(dǎo)宿主的免疫應(yīng)答等作用緊密相關(guān)。該蛋白上相關(guān)位點(diǎn)的氨基酸變異,對(duì)乙腦病毒神經(jīng)侵襲力及神經(jīng)毒力有重要的影響。另外,E蛋白還是引起宿主機(jī)體免疫及產(chǎn)生中和抗體的主要抗原蛋白,由它形成表面抗原決定簇,具有一定的血凝活性和中和活性。它能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體,保護(hù)機(jī)體免受病毒攻擊。因此,人們歷來(lái)把研究重點(diǎn)放在E蛋白上,深入研究其高級(jí)結(jié)構(gòu)和功能,這將為基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用以及新型疫苗研究提供分子水平的依據(jù)。

NS1:是一種分泌型糖蛋白,約含350個(gè)氨基酸殘基,蛋白分子內(nèi)存在二硫鍵。NS1常以二聚體形式出現(xiàn),它可能參與早期的病毒復(fù)制以及病毒組裝和釋放,是主要的抗原成分之一。研究表明黃病毒NS1蛋白在基因和表型水平上具有異乎尋常的高度同源性,可以作為RT-PCR檢測(cè)和亞單位疫苗研制的材料。NS2A、NS2B的分子質(zhì)量分別為17 ku和13 ku,均為疏水性蛋白,同源性較低,可能與膜功能相關(guān)。NS3:分子質(zhì)量64 ku,兩端的氨基酸均為親水性蛋白,是一個(gè)具有解旋酶和激酶特性的功能蛋白。NS4:分為NS4A和NS4B 2種蛋白,分子質(zhì)量分別為28 ku和14 ku,均為疏水蛋白,其結(jié)構(gòu)和功能還不是非常的清楚。NS5:分子質(zhì)量為103 ku,在黃病毒中同源性最高,可能參與病毒RNA聚合酶的合成[1]。

2 原代地鼠腎細(xì)胞滅活疫苗

本疫苗的毒株為北京P3株,通過(guò)原代地鼠腎細(xì)胞培養(yǎng)制備,1968年在中國(guó)開始生產(chǎn)和使用。在非流行區(qū)免疫2針后的抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率為60%,在流行區(qū)免疫2針后抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率為57.23%,1年后加強(qiáng)免疫1針,抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率上升為95.95%[2]。根據(jù)我國(guó)不同流行區(qū)的調(diào)查,該疫苗的保護(hù)率在76%～94%[3]。但是該疫苗不僅存在雜蛋白較多、抗原含量較低、免疫持久性差等缺點(diǎn),而且不良反應(yīng)發(fā)生率較高。

3 原代地鼠腎細(xì)胞減毒疫苗

原代地鼠腎細(xì)胞減毒疫苗,是目前唯一用于人類的乙腦減毒活疫苗,并已寫入WHO規(guī)程。它是我國(guó)俞永新等學(xué)者用具有良好免疫原性的減毒株SA14-14-2,通過(guò)原代地鼠腎細(xì)胞培養(yǎng)制備的活疫苗。與原代地鼠腎細(xì)胞滅活疫苗相比,乙腦減毒活疫苗能激發(fā)更強(qiáng)特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng),血清中和抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率更高,持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)[4]。該疫苗在非流行區(qū)注射1針以后,人體中和抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率為92.3%～100%,在流行區(qū)使抗體陰性兒童的抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率達(dá)94.74%。1996年由賓夕法尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院和華西醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合在成都對(duì)該疫苗效果調(diào)查的結(jié)果顯示,接種1針的保護(hù)率為80%,2針為97.5%。關(guān)于疫苗的安全性,根據(jù)疫苗研制過(guò)程對(duì)58萬(wàn)名兒童的觀察,以及目前每年約5 000萬(wàn)人的疫苗接種,未見嚴(yán)重異常反應(yīng)。由華西醫(yī)科大學(xué)、賓夕法尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院、美國(guó)疾病控制中心等,對(duì)成都13 266名1～2歲兒童進(jìn)行疫苗接種的觀察,證實(shí)SA14-14-2活疫苗的安全性良好。原代地鼠腎細(xì)胞減毒疫苗從1989年開始生產(chǎn),已累計(jì)使用約2億人次,證實(shí)其具有不良反應(yīng)少、免疫原性強(qiáng)、注射針次少等優(yōu)點(diǎn)?，F(xiàn)主要大規(guī)模應(yīng)用于中國(guó)大陸地區(qū),也已出口韓國(guó)和其他一些國(guó)家。

4 鼠腦滅活疫苗

該疫苗是目前得到國(guó)際廣泛承認(rèn)和使用的JE疫苗之一,也在美國(guó)獲得批準(zhǔn)上市使用。鼠腦滅活疫苗于1954年在日本首次獲準(zhǔn),然后在20世紀(jì)60年代和80年代進(jìn)行改進(jìn)。類似的疫苗在亞洲幾個(gè)國(guó)家生產(chǎn)是用Nakayama或者北京-1株,美國(guó)是用Nakayama-NIH株。鼠腦滅活疫苗在幾個(gè)乙腦流行的國(guó)家能夠有效地控制疾病,比如在日本、韓國(guó)、臺(tái)灣和泰國(guó)等。

對(duì)于來(lái)自無(wú)傳染源國(guó)家的人群,建議在第0、7、30 d分別接種鼠腦滅活疫苗3針。對(duì)于乙腦流行國(guó)家的兒童通常接種2針的鼠腦滅活疫苗,時(shí)間間隔1～4周,并且在一年后加強(qiáng)1針[5]。在亞洲地區(qū)人體免疫接種2針后血清中和抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率在85%以上,接種3針達(dá)88%～100%。當(dāng)然只接種1針鼠腦滅活苗基本上是無(wú)效的。

少數(shù)研究評(píng)估了在初始免疫或者加強(qiáng)免疫后保護(hù)的持久性。在接受3針免疫的美國(guó)軍事人員中,在免疫后2年和3年間,分別有100%和94%的人含有保護(hù)性中和抗體[6]。在日本無(wú)乙腦感染地區(qū)的研究顯示,92%的受試者在加強(qiáng)免疫后2年仍有保護(hù)性抗體[7]。在日本乙腦低流行地區(qū)的一項(xiàng)研究顯示,17名隨機(jī)兒童,有82%的人在加強(qiáng)免疫后5年仍有保護(hù)性抗體,并且有53%的人在加強(qiáng)免疫后仍然能保護(hù)10年[8]。

鼠腦滅活疫苗相對(duì)安全,但仍對(duì)接種的兒童和成人存在一定的不良反應(yīng)。局部紅斑、疼痛、注射部位腫脹在接種者中出現(xiàn)率高達(dá)23%,而發(fā)熱、頭疼和頭暈等現(xiàn)象在接種者中出現(xiàn)率高達(dá)13%[9]。也出現(xiàn)過(guò)嚴(yán)重但很少見的過(guò)敏和神經(jīng)系統(tǒng)的不良反應(yīng),包括全身蕁麻疹和四肢、面部和口咽血管性水腫,在一些病人中還伴隨著支氣管痙攣、呼吸困難和低血壓。此外,和接種乙腦疫苗有關(guān)的嚴(yán)重或者致命的急性傳染腦脊髓炎 (腦脊髓炎)病例以前在日本和韓國(guó)也報(bào)道過(guò)。為了應(yīng)對(duì)這些情況,在2005年,日本暫停了鼠腦滅活疫苗的常規(guī)接種。在審查是否繼續(xù)使用該疫苗的決定時(shí),世界衛(wèi)生組織全球疫苗安全咨詢委員會(huì)認(rèn)為,雖然沒有證據(jù)證明腦脊髓炎與鼠腦滅活疫苗有關(guān)系,但是該委員會(huì)建議,鼠腦滅活疫苗應(yīng)逐漸被新一代乙腦疫苗代替[10,11]。

5 Vero細(xì)胞滅活疫苗

Vero細(xì)胞滅活疫苗是乙腦SA14-14-2株在Vero細(xì)胞上培養(yǎng)制備的。成品不包含明膠穩(wěn)定劑、抗生素或硫柳汞。2009年3月在美國(guó)批準(zhǔn)對(duì)17歲及以上人群使用。由于Vero細(xì)胞滅活疫苗是17歲及以上人群使用的,所以鼠腦滅活疫苗仍然是唯一的兒童使用疫苗。為了滿足兒童疫苗的使用,賽諾菲巴斯德已經(jīng)預(yù)留了部分鼠腦滅活疫苗。

對(duì)Vero細(xì)胞滅活疫苗的免疫學(xué)研究沒有很有效的數(shù)據(jù)。該疫苗能夠獲得美國(guó)批準(zhǔn)是因?yàn)樗軌蛘T導(dǎo)具有保護(hù)性的乙腦中和抗體和大約5 000人的安全性評(píng)價(jià)。非劣性免疫原性的研究比較了對(duì)18歲及以上人群在第0 d和28 d接種2針Vero細(xì)胞滅活疫苗和在第0、7、28 d接種3針鼠腦滅活疫苗。研究表明,96%接種Vero細(xì)胞滅活疫苗的受試者PRNT50≥10,接種鼠腦滅活疫苗的則為94%。Vero細(xì)胞滅活疫苗受試者的中和抗體平均滴度為244,鼠腦滅活疫苗的則為102。但是,Vero細(xì)胞滅活疫苗的中和抗體分析是用乙腦SA14-14-2株,而鼠腦滅活疫苗是用乙腦Nakayama株[12]。

Schuller等[13]評(píng)價(jià)了對(duì)已有蜱傳腦炎病毒抗體的受試者接種Vero細(xì)胞滅活疫苗后的反應(yīng),結(jié)果表明蜱傳腦炎病毒抗體在第一針注射時(shí)能增加對(duì)Vero細(xì)胞滅活疫苗的應(yīng)答,而第二針就沒有影響了。在第一針注射Vero細(xì)胞滅活疫苗后,在有蜱傳腦炎病毒IgG下有77%的受試者產(chǎn)生了乙腦抗體,而沒有蜱傳腦炎病毒抗體的只有49%的受試者有抗體。但是,在第二針免疫Vero細(xì)胞滅活疫苗后,有和沒有蜱傳腦炎病毒抗體的受試者基本都會(huì)產(chǎn)生JEV抗體,分別為96%和91%。中和抗體滴度在第二針免疫后也基本上一樣,分別為207和187。

在中歐的一項(xiàng)研究評(píng)價(jià)了Vero細(xì)胞滅活疫苗中和抗體的持續(xù)時(shí)間,在免疫兩針的受試者中,有95%的人在第一次免疫后6個(gè)月仍有抗體,83%的人在第一次免疫后12個(gè)月仍有抗體[14]。然而,同樣的研究在西歐和北歐,兩次免疫Vero細(xì)胞滅活疫苗的人群,只有83%的人在第一次免疫6個(gè)月后有抗體,并且在第一次免疫后12 h和24 h血清保護(hù)率也分別下降到58%和48%[15]。

一項(xiàng)臨床試驗(yàn)對(duì)同時(shí)接種Vero細(xì)胞滅活乙腦疫苗與甲肝疫苗進(jìn)行了研究,結(jié)果表明二者相互沒有影響[16]。在58例同時(shí)接種Vero細(xì)胞滅活乙腦疫苗和甲肝疫苗的受試者中,全部都產(chǎn)生了乙腦的中和抗體,而只接種Vero細(xì)胞滅活疫苗的仍有98%的產(chǎn)生了抗體。中和抗體滴度也基本上一樣,分別為203和192。另外同時(shí)接種Vero細(xì)胞滅活乙腦疫苗和甲肝疫苗的都會(huì)100%產(chǎn)生甲肝抗體,而只接種甲肝疫苗的僅有96%產(chǎn)生抗體。但是,獲得的抗體在男女之間是卻存在差異,并且血清轉(zhuǎn)陽(yáng)和抗體滴度依賴于所用到的甲肝抗體。這些數(shù)據(jù)對(duì)臨床有沒有意義目前還不清楚。

在印度,研究人員對(duì)1歲和2歲的兒童使用標(biāo)準(zhǔn)劑量 (6 μ g)或者半劑量 (3 μ g)接種Vero細(xì)胞滅活疫苗的安全性和免疫原性進(jìn)行了研究[17]。2組兒童隔28 d接種2針。第三組兒童接種3針乙腦鼠腦滅活疫苗 (JenceVac)分別在第0、7、28 d。JenceVac由the Korean Green Cross Vaccine Corporation生產(chǎn),并且是沒有在美國(guó)獲得批準(zhǔn)的。在28 d接種完全以后,6 μ g Vero細(xì)胞滅活疫苗接種組、3 μ g Vero細(xì)胞滅活疫苗接種組和鼠腦滅活疫苗接種組,血清轉(zhuǎn)陽(yáng)率分別為95%、96%和91%,中和抗體滴度分別為218、201、230。在血清轉(zhuǎn)陽(yáng)率和中和抗體滴度沒有差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步的兒童臨床試驗(yàn)正在計(jì)劃之中。

由Vero細(xì)胞滅活疫苗引起的局部和全身不良反應(yīng)報(bào)告和鼠腦滅活疫苗或者單獨(dú)使用安慰劑佐劑的類似。在參與臨床實(shí)驗(yàn)的受試者中沒有嚴(yán)重的過(guò)敏反應(yīng)和神經(jīng)副作用。但是,Vero細(xì)胞滅活疫苗的研究少于5 000名成年人,所以也不排除有嚴(yán)重不良反應(yīng)的可能性。在非劣性免疫原性實(shí)驗(yàn)中,接種Vero細(xì)胞滅活疫苗出現(xiàn)不良反應(yīng)的頻率和接種鼠腦滅活疫苗類似[12]。約有≤1%接種Vero細(xì)胞滅活疫苗的人出現(xiàn)紅斑、腫脹、注射部位疼痛等癥狀。全身的不良反應(yīng)一般是輕微的,最常見的不良反應(yīng)事件是每次接種后7 d內(nèi)出現(xiàn)頭痛 (26%)、肌痛 (21%)、流感 (13%)和疲勞 (13%)。

6 其他疫苗

隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展,人們努力尋找著既安全有效又價(jià)廉易得的新型JE疫苗。新型的乙腦疫苗主要包括嵌合病毒疫苗、DNA疫苗、蛋白質(zhì)疫苗和亞單位疫苗等。雖然這些基因工程類疫苗有著很大的潛力和應(yīng)用前景,但還需要相關(guān)研究人員更多的努力才可能服務(wù)于人類。

7 結(jié)語(yǔ)

原代地鼠腎細(xì)胞滅活疫苗和原代地鼠腎細(xì)胞減毒疫苗主要是在我國(guó)使用,并且后者使用較多。但是由于存在地鼠腎細(xì)胞基質(zhì)認(rèn)證、批準(zhǔn)等問(wèn)題,原代地鼠腎細(xì)胞減毒疫苗尚未在國(guó)際上大規(guī)模使用。鼠腦滅活疫苗由于存在較多的不良反應(yīng),目前在一些地方和國(guó)家已經(jīng)停止接種和生產(chǎn)。剛通過(guò)美國(guó)認(rèn)證的Vero細(xì)胞滅活疫苗,將會(huì)為更多的人帶來(lái)方便。相信隨著生物技術(shù)的迅猛發(fā)展及人們認(rèn)識(shí)的深入,人們終將會(huì)研究出更為安全、高效、價(jià)廉的乙型腦炎疫苗。

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