蒿若超,武美燕 (長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院,湖北荊州434025)

植物染色體制片技術(shù)是植物細胞遺傳學(xué)、染色體工程、植物細胞生物學(xué)、植物細胞分類學(xué)和物種生物學(xué)等眾多學(xué)科的基本實驗技術(shù)[1,2]。目前,快速制備染色體臨時片主要采用壓片技術(shù)[3,4]。但是該實驗操作步驟中壓片要求較高的制片熟練程度,且乙酸洋紅染色后,著色程度受乙酸洋紅影響很大,染色體和細胞質(zhì)不易區(qū)分,很難獲得效果好的壓片[5,6]。改良后的染色劑和制片方法克服了上述的缺點,對于初學(xué)者來說,不僅方法簡便,還可獲得效果很好的植物細胞染色體臨時片。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以蠶豆 (Vicia f aba,2n=12)和玉米 (Zea mays,2n=20)雄穗為試材。

1.2 改良蘇木精染色劑配制

A液:在100 mL錐形瓶中,用50 mL無水乙醇溶解2 g蘇木精,搖動即可溶解。B液:在1 000 mL錐形甁中,用700 mL蒸餾水溶解20 g硫酸鋁鉀,使用磁力攪拌器即可快速溶解。將A液加入到B液中混合后,加入0.2 g碘酸鈉 (NaIO3),搖動至顏色加深。最后加入20 mL冰醋酸,搖動顏色變?yōu)樯钇咸丫萍t色,染液配制當(dāng)日即可應(yīng)用于染色。

1.3 染色體制片

(1)解離 將固定好的蠶豆根尖用蒸餾水沖洗3遍,吸干水分后放入1 mol/L的鹽酸溶液中,在60℃水浴鍋中解離18 min后,蒸餾水反復(fù)沖洗3遍,放在吸水紙上吸干。

(2)染色 將解離后的蠶豆根尖放入蘇木精染色劑中染色10 min。染色后的植物根尖分生區(qū)呈深紅色,非常方便切取。

(3)壓片 將染色后的蠶豆根尖置于載玻片上,切取根尖分生組織1.5 mm,用尖頭鑷子將根尖壓碎,加一滴蘇木精,蓋上蓋玻片,用吸水紙壓住蓋玻片,再用鉛筆的橡皮頭垂直輕敲幾下,最后用吸水紙吸干多余的染色液;取玉米雄穗1枚花藥放在潔凈的載玻片上,用鑷子壓碎花藥,再滴1滴改良的蘇木精染色液,蓋上蓋玻片,最后用吸水紙吸干多余的染色液。

2 結(jié)果與分析

2.1 改良蘇木精與傳統(tǒng)Harris's蘇木精比較

同時配置兩種蘇木精染色液各1 000 mL,比較主要成分用量及配置時間,列于表1。結(jié)果表明,配置相同體積的2種蘇木精染色液,配置改良蘇木精染色液的各成分用量都小于配置傳統(tǒng)Harris's蘇木精染色液的用量。其中,傳統(tǒng)Harris's蘇木精染色液使用氧化汞作為氧化劑,改良蘇木精染色液使用碘酸鈉作為氧化劑;配置傳統(tǒng)Harris's蘇木精染色液需要2 d完成,而配制改良蘇木精染色液只需20 min。原因硫酸鋁鉀的溶解度 (100 g H2O中)在0、10、20、30、40、60、80、90 ℃分別是3、3.99、5.9、8.39、11.7、24.8、71、109 g。故在冷卻時,傳統(tǒng)Harris's蘇木精染液就會有硫酸鋁鉀沉淀析出,需在配置染色液的第二天進行過濾后,才能使用。

表1 2種蘇木精染色液配制比較表

2.2 改良制片方法與常規(guī)制片方法比較

將改良制片方法與常規(guī)制片方法的主要細節(jié)進行比較,列于表2。從表2可以看出,解離步驟在2種方法中是相同的;在染色步驟過程中,常規(guī)方法使用醋酸洋紅染色劑,且染色時要在火焰上加熱煮沸3至6次。通常實驗結(jié)果表明,醋酸洋紅的染色效果不如蘇木精的染色效果。學(xué)生在火焰上加熱煮沸時,由于掌握不好時機,染色液容易沸騰蹦出,有較大的危險性。而在改良染色方法中,只需將植物材料浸泡在染色液中,不存在危險性;在壓片過程中,常規(guī)壓片是蓋上蓋玻片后用手指按壓使細胞分散。在實驗過程中,如果力度掌握不好,很容易把蓋玻片壓碎。在改良壓片方法中,先用鑷子將植物根尖壓碎,使細胞分散,再蓋上蓋玻片。不需要再用手指壓蓋玻片,這樣就不會將蓋玻片壓碎。

表2 改良制片方法與常規(guī)制片方法比較

2.3 改良蘇木精的染色效果

圖1是蠶豆根尖細胞有絲分裂在10×目鏡下的觀察圖。圖2是玉米雄穗花粉母細胞減數(shù)分裂在10×目鏡下的觀察圖。從圖1可以看出,首先在一個視野下出現(xiàn)較多的分裂相,便于學(xué)生觀察。其次,使用改良蘇木精染色后,染色體呈深紅色,而細胞質(zhì)背景呈透明色,使得染色體形態(tài)觀察的非常清晰。從圖2可以看出,玉米花粉母細胞減數(shù)分裂過程中四分體時期染色非常清晰。

圖1 蠶豆根尖細胞染色體染色效果

圖2 玉米雄穗花粉母細胞染色效果

3 討論

植物根尖細胞染色體制片技術(shù)是遺傳學(xué)實驗中最常見的實驗之一。按照傳統(tǒng)實驗方法進行根尖細胞染色體觀察,往往由于實驗中的很多細節(jié)沒有掌握好,花費很長時間也做不出質(zhì)量好的片子,因此要求實驗人員改進染色方法和改良染色劑,以求達到通過簡單的幾個操作,就能做出質(zhì)量較好的染色體片子。

傳統(tǒng)的Harris's蘇木精染色液配置需要 “成熟”2個月才能使用,且放置長時間后出現(xiàn)很多沉淀,給制片帶來很多麻煩。本研究中,染色液通過采用強氧化劑碘酸鈉,加速蘇木精氧化,達到染色液當(dāng)天配置當(dāng)天使用,不需等待很長時間。同時,減少媒染劑硫酸鋁鉀用量,基本低于硫酸鋁鉀的溶解度,避免了染色液在配置長時間后析出沉淀的問題。

傳統(tǒng)的壓片技術(shù)操作過程中,壓片的力度要求有較高的熟練程度才能既把染色體分散開,又不會把蓋玻片壓破。而改進的操作是直接用鑷子壓碎材料后再放蓋玻片。這樣染色體分散均勻,又同時還可以防止蓋片被壓碎。

通過改良的植物根尖細胞染色體制片方法,使染色體制片實驗變的相對簡單易做,而且該方法用于不同植物材料的染色體制片中,效果都較好。

[1]李懋學(xué),張贊平.作物染色體及其研究技術(shù) [M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,1996.1-40.

[2]李懋學(xué),張敩方.植物染色體技術(shù) [M].哈爾濱:東北林業(yè)大學(xué)出版社,1991.1-53.

[3]朱 微.植物染色體及染色體技術(shù) [M].北京:科學(xué)出版社,1982.42-87.

[4]祝水金.遺傳學(xué)實驗指導(dǎo) (第2版)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2005.14-17.

[5]詹少華.大豆根尖染色體制片實驗的教學(xué)改革[J].皖西學(xué)院學(xué)報,2009,25(2):65-67.

[6]陳 高,孫 航,孫衛(wèi)邦.改進的植物染色體制片方法[J].植物生理學(xué)通訊,2007,43(4):65-67.