蔣 斌 魏 駿

(巢湖職業(yè)技術學院 安徽巢湖 238000;①巢湖市壩鎮(zhèn)衛(wèi)生院)

血吸蟲病(schistosomiasis)是呈世界性分布的嚴重危害人類及家畜的寄生蟲病，發(fā)病率僅次于瘧疾(malaria)。全世界至少有2億血吸蟲病感染者。該疾病流行區(qū)仍有6億人受其威脅[1]，我國是受日本血吸蟲病危害最為嚴重的國家之一，流行株為日本血吸蟲中國大陸株(Chinese Mainland Strain)，全國血吸蟲病流行縣(市、區(qū))454個;累計達到血吸蟲病傳播消滅標準的縣(市、區(qū))265個，2009年度，我國實有患者36.6萬人[2]。本文概述了防治日本血吸蟲病的核酸疫苗的免疫機制、特點及我國日本血吸蟲核酸疫苗候選分子的研究進展。

1 核酸疫苗的免疫機制及特點

1990年Wolff等[2]人將DNA重組表達載體注入小鼠的骨骼肌中，結果意外發(fā)現(xiàn)載體上的基因在局部肌細胞內表達，且產生了抗體，這一偶然發(fā)現(xiàn)導致核酸疫苗的誕生。由于大多利用質粒DNA載體進行核酸疫苗研究，因而核酸疫苗又稱為DNA疫苗。

1.1 核酸疫苗的免疫機制 免疫機制主要有以下3點:①核酸疫苗接種后，被結合在游離核糖體上的mRNA翻譯而表達合成的內源性抗原蛋白，其中一部分以有效的比例結合到泛肽上，呈遞給蛋白酶，降解為多肽，通過抗原肽轉運結構(TAP)運送到內質網(wǎng)腔，與MHC－Ⅰ類分子形成聚合體，抗原多肽－MHC－Ⅰ類分子聚合體通過內質網(wǎng)進入高爾基體，最終到達細胞膜的表面，誘發(fā)CD8+細胞毒性T細胞應答的產生。②另一部分蛋白抗原從分泌它們的抗原遞呈細胞(APC)的細胞膜上進入MHC－Ⅱ類型途徑，進入MHC－Ⅱ類呈遞途徑的蛋白在溶酶體中水解，產生大約20～25個氨基酸的多肽，這些溶酶體和包含MHC－Ⅱ分子的囊泡融合，MHC－Ⅱ分子結合合適的多肽形成MHC異聚體，成熟的MHC異聚體在細胞膜表面刺激CD4+T細胞，引發(fā)體液免疫應答。③一部分抗原多肽遞呈給B細胞，使B細胞自身活化，產生特異性抗體，誘發(fā)體液免疫。另外，遞呈后的CD4+輔助性T細胞(Th)活化、增殖可產生多種細胞因子，進一步促進和強化體液免疫和細胞免疫。胞內型的蛋白分子在與MHC－Ⅰ類分子結合后，是誘導細胞免疫的最好抗原形式。

1.2 核酸疫苗的特點 與傳統(tǒng)疫苗相比，核酸疫苗有以下優(yōu)點:①可以模擬減毒活疫苗產生全身性保護性免疫反應，而不需使用復制型載體或活的微生物就可產生細胞毒性T淋巴細胞(CTL)，在宿主細胞內合成的蛋白質經歷了加工、修飾，然后遞呈給宿主免疫系統(tǒng)等與自然感染相似的過程，更接近天然分子形式包含構型相關位點，因而能誘導更有效的免疫應答。②生產簡便、成本低廉、穩(wěn)定性好且貯存方便。質粒DNA可以制成干粉樣制劑型，在常溫下穩(wěn)定，便于儲存和運輸。③可誘導出全方位免疫，包括細胞免疫和體液免疫。核酸疫苗免疫后，可檢測出較高滴度的特異性抗體和CTL反應。④使用安全，沒有感染病原體的危險，利用質粒作載體，不涉及感染性因子。⑤同種異株的交叉保護作用。采用同種不同株之間的保守DNA序列作核酸疫苗，可以使其免疫作用突破地理株的限制，同種異株間有交叉免疫保護作用。⑥將不同病原體的DNA序列克隆到同一質粒載體輸入機體聯(lián)合免疫，可產生對兩種病原體的共同保護作用。⑦不僅有良好的預防作用，而且對現(xiàn)癥患者有一定的治療作用。

2 我國候選血吸蟲核酸疫苗的研究

2.1 副肌球蛋白(Sj97)97kDa的副肌球蛋白是大多數(shù)無脊椎動物(包括血吸蟲)肌肉組織內的一種結構蛋白，分子量為97kDa。Yang等首先報道了用編碼日本血吸蟲97kDa分子的基因片段cDNA與真核細胞表達載體pRSV－BL構建裸露DNA，即PMY6，然后直接注射小鼠股四頭肌，產生了識別日本血吸蟲97kDa蛋白的抗體。陳家旭等[3]報道將40只C57BL/6小鼠隨機分成疫苗組、空質粒組、感染對照組和空白對照組攻擊感染后7周，剖殺小鼠檢測肝臟蟲卵肉芽腫直徑Sj97DNA疫苗組(183.75±42.36)μm，顯著小于空質粒組的(303.12 ±37.36)μm 和感染對照組的(304.38±53.23)μm，表明Sj97DNA具有一定的抗蟲卵肉芽腫及抗肝纖維化作用。

2.2 谷光甘肽－S－轉移酶(GST)GST是以谷胱甘肽為共同底物的一組具有解毒功能的同工酶，被公認為具有很大潛在價值的疫苗分子。日本血吸蟲至少有兩種26kDa和28kDa的同工酶(Sj26、Sj28)。血吸蟲的GST含量豐富，有助于其在宿主體內寄生。Shi Fuhui等以Sj28 GST肌注免疫綿羊，先以200條尾蚴攻擊感染，得到65.0%的減蟲率和70.5%肝組織減卵率。但第二次實驗以300條尾蚴攻擊感染，獲得30.4%減蟲率和43.1%肝組織減卵率，效果不顯著。Sj28GST核酸疫苗對黃牛進行田間免疫試驗，取得明顯的免疫保護效果，減蟲率43.6%，糞便減卵率76.9%。提示用此疫苗對黃牛進行大規(guī)模免疫預防，可減少人群感染的機會。楊平等[4]用構建的pIRES－Sj26疫苗肌肉注射免疫BALB/c小鼠，檢測血清總IgG抗體濃度、INF－γ的含量明顯高于空白對照組和空載體組;其脾臟大小指數(shù)(脾SI)高于空白對照組和空載體組;CD8+細胞百分比高于空白對照組和空載體組，表明pIRES－Sj26疫苗能增強BALB/c小鼠的免疫應答反應。

2.3 23 kDa膜蛋白(Sj23)Sj23的結構區(qū)與一組哺乳動物膜蛋白(如淋巴細胞表達蛋白CD37、CD53和TAPA－1等)的表面標志CD53同源，這組膜蛋白的主要功能與細胞增殖有關。因此Sj23在細胞增殖和血吸蟲生長中起著重要作用。李柳哲等將日本血吸蟲真核表達載體pBK－Sj23，pBK－Sj26以及pCDSj23，pCD－Sj26，分別接種小鼠股四頭肌，結果發(fā)現(xiàn)疫苗pCDSj23和pCD－Sj26誘導小鼠的減蟲率和減卵率分別為30.5%和33.0%，疫苗pBK－Sj23和pBK－Sj26誘導小鼠的減蟲率和減卵率分別為18.2%和21.7%，含血吸蟲同一抗原分子的不同載體誘導小鼠的抗攻擊感染能力具有顯著性差異。柳建發(fā)等[5]用編碼Sj23－pcDNA質粒免疫的小鼠產生了針對Sj23的特異性IgG，而pcDNA對照組免疫小鼠血清則無此作用，也證明Sj23－pcDNA疫苗對日本血吸蟲攻擊感染有一定的保護力。

2.4 天冬酰胺肽鏈內切酶(Sj32) 國內學者對Sj32核酸疫苗進行了深入的研究，并取得了一些可喜成績。謝來平等分別以100μg/100μL的pCD－Sj32經股四頭肌注射免疫 BALB/c小鼠，結果各免疫組與對照組相比均產生較好的保護免疫效果，減成蟲率為35.6%～44.44%，肝組織減卵率為39.6%～69.1%。Wei F等[6]將pVAX/Sj26GST和pVAX/Sj26GST+ILl8共同免疫小鼠，減蟲率分別為30.1%和49.4%，相應的肝臟和糞便的減卵率分別為44.8%、53.0%和50.6%、56.6%。

2.5 磷酸丙糖異構酶(TPI)TPI為二聚體糖酵解酶，它是一種優(yōu)勢蛋白，分布于各種生物的所有組織中，也是一種重要的抗血吸蟲病疫苗候選分子。魯飛等[7]利用磷酸丙糖異構酶基因(TPI基因)密碼子優(yōu)化后的DNA疫苗分A(pcDNA3.1空質粒對照組)、B(pcDNA3.1－TPI組)、C(pcDNA3.1 －TPI－mHSP70組)、D(pcDNA3.1－TPLopt組)、E(pcDNA3.1－TPLopt－ mHSP70組)等5組免疫BALB/C小鼠，B、C、D、E組小鼠血清均檢測到特異性IgG及IgG2a與IgG1抗體，IgG2a/IgG1的比值分別為1.73、2.06、2.44、3.09。D、E 組的 IL －2、IFN－γ、TNF 含量較B、C組均有不同程度地升高。D、E組減蟲率分別為36.03%、39.03%，減卵率分別為41.71%、46.85%，均顯著高于 B、C 組(P＜0.01)，表明TPI基因密碼子優(yōu)化后的DNA疫苗相對于未優(yōu)化TPI DNA疫苗能誘導小鼠產生較高的免疫保護作用，且誘導宿主產生較強的以Th1為主的免疫應答。

2.6 脂肪酸結合蛋白(FABP) 脂肪酸結合蛋白是血吸蟲脂代謝過程中的必需載體，對血吸蟲在脊椎動物宿主體內的發(fā)育起決定作用。FABP分子既可作為疫苗候選分子又可作為藥物靶。其全基因序列為578bp(mRNA)，內含一個399bp的編碼區(qū)。余傳信等構建的重組真核表達質粒SjFABP－pcDNA3.1，通過肌肉注射免疫BALB/c小鼠，顯示該核酸疫苗有一定的抗血吸蟲感染的保護性作用。朱曉華等[8]成功構建和表達重組質粒pVIV02－Sj14FABP，免疫BALB/c小鼠，分別獲得24.1%的減蟲率和27.2%的減卵率，表明該核酸疫苗能夠誘導小鼠產生部分抗血吸蟲感染的保護力。

2.7 粘蛋白樣蛋白(MLP) 血吸蟲的MLP屬于性發(fā)育調節(jié)蛋白的一種，其基因是目前所知的唯一不在卵黃腺表達的血吸蟲雌蟲特異性序列。劉彥等[9]將日本血吸蟲 pcDNA3.1(+)/MLP核酸疫苗對家兔免疫作用，結果可明顯抑制家兔肝臟蟲卵肉芽腫的大小，肉芽腫數(shù)量減少，肝組織減卵率為28.1%，并可誘導IgA、IgG1變化，誘生INF－γ應答，表明該疫苗對日本血吸蟲尾蚴攻擊感染可產生一定的保護作用。

2.8 日本血吸蟲信號蛋白14－3－3(Sj14－3－3) 劉慶中等[10]將Sj14－3－3DNA免疫BALB/c小鼠進行攻擊感染實驗，6周后，剖殺小鼠減蟲率與減卵率分別為34.2%和50.7%，表明重組Sj14－3－3DNA具有一定的抗血吸蟲病潛能，有可能作為日本血吸蟲病的候選疫苗。李德發(fā)等將765bp的Sj14－3－3編碼基因插入pBK－CMV，構建pBK－Sj14－3－3。將100g重組質粒肌肉注射免疫BALB/c鼠，3周后加強1次，末次免疫后5天用40條Sj尾蚴進行攻擊，攻擊后6周發(fā)現(xiàn)免疫鼠的減蟲率和肝組織的減卵率分別為27%和79%，鼠肝肉芽腫直徑減少29%，表明pBK－Sjl4－3－3也可誘導小鼠產生一定的保護力。

2.9 SjCWL01 該基因全長636bp，開放閱讀框(ORF)分析含有一個462bp大小的完整閱讀框，其起始密碼子為ATG，位于第68～70個核苷酸，終止密碼子TAG，位于第527～529位核苷酸，3＇端有較長的PolyA尾。基因編碼153個氨基酸，理論分子量為17.5kDa。彭先楚等[11]構建了日本血吸蟲 pcDNA3/SjCWL01 核酸疫苗免疫小鼠結果顯示，重組DNA疫苗與對照組比較，蟲荷、每克肝卵、每克糞卵數(shù)分別下降了27.6%、39.5%、45.9%，表明該疫苗具有誘導小鼠產生部分抗血吸蟲感染的保護力。

2.10 混合或多價疫苗 血吸蟲病各種核酸疫苗作為單一成分在動物免疫保護試驗中都不同程度地取得了成功，而血吸蟲是一種多細胞生物，生活史復雜，在長期與宿主共進化的過程中產生了多種免疫逃避機制。目前混和(或)多價核酸疫苗被廣泛研究。

李春艷等[12]成功構建日本血吸蟲多價DNA疫苗pVIVO2－SjFABP－23，免疫小鼠進行免疫保護性實驗，獲得52.1%減蟲率和60.9%的減卵率，且均高于單價疫苗pVIVO2－Sj23。夏濤等[13]用二價DNA疫苗pVIVO2－SjFABP－SjGST在體內誘發(fā)的特異性抗體分別與pET30a－SjFABP及pET30a－SjGST原核表達的抗原蛋白產生特異性免疫反應。徐元宏等[14]在證明核酸疫苗pcDNA3.1(+)－Sj14－3－3具有部分抗血吸蟲感染的基礎上，聯(lián)合使用CpG和pcDNA3.1(+)－mIL－12免疫小鼠，實驗結果 pcDNA3.1(+)－Sj14－3－3+pcDNA3.1(+)－mIL－12和pcDNA3.1(+)－Sj14－3－3+CpG免疫小鼠的減蟲率分別為41.2%和28.7%;減卵率分別為52.6%和41.2%。說明核酸疫苗pcDNA3.1(+)－Sj14－3－3抗血吸蟲攻擊感染作用在mIL－12和CpG等佐劑作用下得到增強。余光清等[15]將654bp的Sj26GST的cDNA片段克隆入pEGFP－N3，構建pEGFP－Sj26GST;將100μg的pEGFP－Sj26GST肌肉注射免疫BALB/c鼠，2周后加強1次，4周后用50μg的rSj26GST抗原皮下注射加強1次，末次免疫后2周后用40條Sj尾蚴進行攻擊，在攻擊6周后免疫鼠的減蟲率和肝組織減卵率分別為50.8%和32.7%，說明pEGFP－Sj26GST質粒可誘導小鼠產生一定的保護力。魏峰等[16]分別以肌肉注射重組質粒pVAX－GST、pIRESneo－Sj23、pVAX－GST－FABP和pIRESneo－GST－FABP－Sj23均能誘導小鼠產生特異性的IgG抗體，pIRESneo－GST－FABPSj23免疫組所誘導的IgG水平最高，減蟲率分別為26.1%、30.8%、33.2%和47.5% ，減卵率分別為25.4% 、45.0%、48.4% 和69.8%。pIRESneo－GST－FABP－Sj23的減卵率和減蟲率明顯高于其他DNA疫苗。魯燕妮等[17]利用從香菇中提取的多糖進行動物實驗，證明植物多糖對日本血吸蟲疫苗pVIVO2－Sj14－Sj23有較好的增效作用，并在此基礎上初步探討了植物多糖佐劑對血吸蟲疫苗的增效機理。胡媛等[18]通過基因拼接法構建pVIVO2－Sj14－3－3－Sj23融合質粒。將pVIVO2－Sj14－3－3－Sj23和 pVIVO2－Sj14－3－3/Sj23等量混合后，建成混合DNA疫苗。將100μg的 pVIVO2－Sj14－3－3/Sj23、pVIV02－Sj14－3－3－Sj23和混合質粒肌肉注射分別免疫BALB/c鼠，4周后用40條Sj尾蚴進行攻擊。攻擊后6周發(fā)現(xiàn)pVIVO2－Sjl4－3－3/Sj23免疫鼠的減蟲率和減卵率分別為41.20%和53.83%，pVIVO2－Sjl4－3－3－Sj23免疫鼠分別為53.26%和39.78%，混合質粒免疫鼠分別為58.97%和47.68%，所有免疫鼠的肝蟲卵肉芽腫體積顯著縮小，提示混合質粒的免疫效果類似于pVIVO2－Sj14－3－3/Sj23或pVIVO2－Sjl4－3－3－Sj23融合質粒。門靜濤等[19]將小鼠IL－18基因和日本血吸蟲Sj23膜蛋白基因分別插入pVAX1載體，構建真核表達質粒pVAX/mlL－18和pVAX/Sj23，聯(lián)合或單獨免疫小鼠，以pVAX1空載體作對照，檢測結果表明，聯(lián)合免疫組能誘導小鼠產生較強的抗日本血吸蟲成蟲可溶性抗原(SWAP)IgG，較高水平的IFN－γ和IL－2。攻蟲試驗表明，聯(lián)合免疫小鼠成蟲減蟲率和肝臟減卵率分別達41.6%和49.4%，明顯高于pVAX/Sj23單獨免疫組(減蟲率和肝臟減卵率分別為26.5%和41.4%)。以上試驗結果表明，IL－18能明顯增強Sj23DNA疫苗在小鼠體內的免疫應答，并且產生較強的保護作用。

這些實驗結果表明，一些抗原分子組成的多基因疫苗或混合佐劑誘導宿主的免疫力往往存在一定程度上的協(xié)同作用，從而提高宿主抗血吸蟲感染的能力。

[1]吳 平，汪世平，溫志立.日本血吸蟲病候選分子疫苗免疫保護力研究進展[J].中國病原生物學雜志，2010，5(6):466

[2]Wolff J A，Malone R W，et al.Direct gene transfer into mouse muscle in vire[J].Science，1990，247:1465

[3]陳家旭，劉述先，曹建平，等.日本血吸蟲副肌球蛋白全基因核酸疫苗對小鼠的抗病免疫效應[J].中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志，2006，24(2):81

[4]楊 平，戴五星，劉朔捷，等.血吸蟲Sj26膜錨定表達DNA疫苗的構建、表達及其免疫原性[J].華中科技大學學報(醫(yī)學版)，2007，36(2):141

[5]柳建發(fā)，湯治元，劉玉新，等.編碼完整膜蛋白Sj23質粒DNA核酸疫苗免疫小鼠及其保護力的研究[J].地方病通報，2008，(5):1

[6]Wei F，Liu Q，Gao S，et al.Enhancement by IL－18 of the protective effect of a Schistosoma japonicum26kDa GST plasmid DNA vaccine in mice[J].Vacine，2008，26(33):4145

[7]魯 飛，朱蔭昌，戴 洋，等.日本血吸蟲TPI DNA疫苗基因密碼子優(yōu)化增強免疫保護作用的研究[J].中國寄生蟲病防治雜志，2009.27(3):189

[8]朱曉華，石佑恩，胡 萍，等.日本血吸蟲脂肪酸結合蛋白DNA疫苗誘導小鼠保護性免疫力的研究[J].中國血吸蟲病防治雜志，2005，17(1):4

[9]劉 彥，肖建華，廖 力，等.日本血吸蟲 pcDNA3.1(+)/MLP核酸疫苗對家兔的保護性免疫作用[J].中國血吸蟲病防治雜志，2004.16(2):126

[10]劉慶中，沈繼龍.日本血吸蟲重組信號蛋白14－3－3DNA免疫保護作用的觀察[J].中國人獸共患病雜志，2004，20(3):230

[11]S852..5彭先楚，汪世平，何 卓.日本血吸蟲 pcDNA3/SjCWL01核酸疫苗的構建及其對小鼠免疫效果觀察[J].中國人獸共患病學報，2007，23(8):752

[12]李春艷，余龍江，劉 智，等.日本血吸蟲 DNA多價疫苗 pVIVO2SjFABP－23的構建及其保護性免疫[J].中國人獸共患病雜志，2006，22(2):122

[13]夏 濤，朱 路，龍全科，等.兩種血吸蟲病DNA疫苗的候選抗原基因研究[J].生物技術通訊，2008，19(2):240

[14]徐元宏，胡元生，沈繼龍.核酸疫苗Sj14－3－3聯(lián)合CpG和mIL－12免疫小鼠抗日本血吸蟲攻擊感染的研究[J].中華微生物學和免疫學雜志，2006，26(7):643

[15]余光清，劉文琪，雷家慧，等.疫苗聯(lián)合免疫的保護作用研究[J].中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志，2006，24(1):51

[16]魏 峰，翟羽佳，劉 全，等.日本血吸蟲多價核酸疫苗的構建及免疫保護試驗[J].中國獸醫(yī)學報，2009，29(8):1013

[17]魯燕妮，馮 清，朱曉華，等.香菇多糖對日本血吸蟲DNA疫苗pVIVO2－Sj14－Sj23的增效作用[J].復旦學報醫(yī)學版，2007，34(3):459

[18]胡 媛，石佑恩，朱曉華，等.不同方式構建的日本血吸蟲雙價DNA疫苗保護力的比較[J].熱帶病與寄生蟲學，2007，5(1):1

[19]門靜濤，劉 全，商利民，等.IL－18增強日本血吸蟲 DNA疫苗Sj23 的免疫保護效果[J].中國獸醫(yī)學報，2009，29(5):610