李曉宇,楊 清,單 清

(1.南京醫(yī)科大學江蘇省心血管病分子干預重點實驗室,江蘇南京,210029;2.江蘇省揚州市第一人民醫(yī)院,江蘇揚州,225001)

大量流行病研究證實高密度脂蛋白(HDL)及其主要的蛋白成分-載脂蛋白A-I(apoA-I)含量的高低與患心血管病的風險呈負相關(guān),被認為是抗動脈粥樣硬化的保護因子[1-2]。急性或慢性炎癥狀態(tài)時下高密度脂蛋白和載脂蛋白AI含量降低[3-4],但其發(fā)生機理不詳。

GPR109A是一種G蛋白偶聯(lián)受體[5-8],其基因在脂肪組織和活化的免疫細胞中高表達?，F(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)脂肪組織中GPR109A激活可以抑制腺苷酸環(huán)化酶活性從而抑制環(huán)磷腺苷的生成,降低蛋白激酶A的活性,減少脂肪細胞中甘油三酯脂解,進而減少游離脂肪酸的釋放,進而降低甘油三酯和低密度脂蛋白含量。作者的前期研究[9]發(fā)現(xiàn)肝細胞中GPR109A的過表達,可以降低細胞內(nèi)環(huán)磷腺苷的釋放,而抑制肝細胞中ABCA1活性,使得肝細胞介導的游離膽固醇向新生apoA-I外流減少,從而降低HDL濃度。

生理狀態(tài)下小鼠巨噬細胞中GPR109A的表達量并不高,但炎癥刺激可大量激活其表達[10]。肝細胞中的GPR109A是否也有類似的調(diào)控規(guī)律,以及炎癥應(yīng)激下的GPR109A是否參與了HDL減少的調(diào)控過程,目前均不清楚。本研究旨在探討炎癥應(yīng)激對肝細胞GPR109A表達的影響,及其對HDL代謝的潛在影響。作者的研究結(jié)果提示,低劑量LPS注射可以在2 h內(nèi)迅速上調(diào)小鼠肝細胞GPR109A的表達,而不是僅誘導了Kupffer細胞中GPR109A的表達上調(diào)。同時,作者也在人的肝細胞株上驗證了相同的結(jié)果。此外,作者發(fā)現(xiàn)炎癥上調(diào)的GPR109A抑制了肝細胞中環(huán)磷腺苷的釋放,也降低了游離膽固醇外流至新生的apoA-I。作者的研究表明炎癥應(yīng)激時肝細胞中上調(diào)的GPR109A參與了血漿HDL減少的調(diào)節(jié)過程,從而提高了心血管事件發(fā)病的危險性。

1 材料和方法

1.1 試劑

煙酸(niacin),福斯高林(Forskolin),3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX),Percoll細胞分離液、脂多糖(LPS)購自美國西格瑪奧德里奇(sigma-aldrich)公司。生理鹽水由南京化學試劑廠生產(chǎn)。環(huán)磷腺苷(cAMP)酶聯(lián)免疫試劑盒由美國R&D公司提供。氚標記的膽固醇(3H-cholesterol)購自美國鉑金埃爾默公司(Perkin Elmer Life Sciences)。RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM 培養(yǎng)基、Williams E培養(yǎng)基、肝臟灌注液、肝臟消化液、肝細胞漂洗液、Hank′s液 ,青鏈霉素混合液和胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購于美國Invitrogen公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

人肝細胞癌細胞株HepG2和小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC),用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,在37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗前,按每孔2×105細胞數(shù)接種于六孔板。

取成年雌性C57BL/6小鼠用門靜脈灌流法結(jié)合Percoll單密度梯度離心法分離小鼠原代肝細胞和Kupffer細胞[11]。腹腔注射70/7 mg/kg氯胺酮和賽拉嗪混合液麻醉小鼠后,無菌操作打開腹腔,切斷下腔靜脈,從門靜脈插管,分別用肝臟灌注液和肝臟消化液原位灌流。收集并剪碎消化好的肝臟,離心,清洗,用 Percoll分離液篩選活的原代肝細胞,以2×105的密度培養(yǎng)在預鋪膠原酶I的十二孔細胞板上。用含10%胎牛血清加雙抗的Williams E培養(yǎng)原代肝細胞。上清液繼續(xù)高速離心,取沉淀用 Hank′s液稀釋,30%～70%Percoll分離液梯度離心后取兩層Percoll之間的一層細胞,RPMI-1640液清洗兩遍,10%FBS培養(yǎng)于12孔板,兩小時后PBS清洗3遍,去除非貼壁細胞。

小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞、J774細胞,小鼠腹腔巨噬細胞(MPM)和小鼠骨髓源性巨噬細胞(BMM)的cDNA由美國賓夕法尼亞大學醫(yī)學院的李輝博士饋贈。

1.3 動物試驗

6～8周雌性C57BL/6J小鼠購自美國Jack-son實驗室,飼予普通嚙齒類動物顆粒,于12 h明暗交替,室溫18～23℃的動物房內(nèi)飼養(yǎng)。所有的實驗操作均經(jīng)過南京醫(yī)科大學動物倫理委員會批準。小鼠隨機分組后腹腔注射 625 μ g/kg的LPS。在不同的時間點,處死動物,行冰PBS心臟灌洗后收集肝臟。組織于RNAlater液體中4℃過夜后,轉(zhuǎn)存-80°C低溫冰箱保存。

1.4 RNA提取及定量PCR

用德國QIAGEN公司的EZ1 RNA Mini Kit試劑盒,按照說明書提取組織及細胞的總RNA。紫外分光光度計鑒定OD260/OD280比值高于1.8。取 1 μ g總 RNA 用美國ABI公司的High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。用美國ABI公司的Applied Biosystems 7300進行實時定量PCR反應(yīng)。引物序列如下:人GPR109A上游5′-ACAACTATGTGAGGCGTTGGGA-3′, 下游 5′-TGGCGGTTCATAGCCAACA-3′,熒光探針 6FAMATCAGCCGGCAAGGGATGTCC-MGXBP;人GPR109B上游 5′-ACTACTATGTGCGGCGTT CAGAC-3′,下游 5′-GGCGGTTCATGGCAA ACA-3′,熒光探針6FAM-ACCAGCCGGCAA GGGATGTCC-MGXBP;人 GPR81上游 5′-GGGTGAGTGCTAACGCTCAGATAAG-3′,下游 5′-AGAAGCCGTCT TGCAATAAGAAAGG-3′,熒光探針6FAM-CATGGTGGTGGCT TC TGTGTT-BHQ;人血清淀粉樣蛋白(serum amyloid A,SAA)上游 5′-GCTGACCAGGAAGC CAACAG-3′,下游 5′-CAGGCAGTCCAGGAG GTCTG-3′,熒光探針 6FAM-CATGGCCGCAGTGGCAAAGACC-TAMRA;人誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)上游 5′-CATTGGAAGTGAAGCGTTCG-3′,下游 5′-CAGCTGGGCTGTACAAACCTT-3′熒 光 探 針 6FAM-CGGGCAGCCTGTGAGACCTTTGA-TAMRA;看家基因人β-actin上游 5′-CTCCTCCTGAGCGCAAGTACTC-3′,下游 5′-TCGTCATACTCCTGCTTGCTGA T-3′,熒光探針 6FAM-CCATCCTGGCCTCGCTGTCCA-TAMRA;小鼠巨噬細胞的標記基因 Mac-2上游 5′-AGGAGAGGGAATGATGTTGCC-3′, 下 游 5′-GGT TTGCCACTCTCAAAGGG-3′,熒光探針6FAM-TCCACTT TAACCCCCGCTTCAATGAGA-TAMRA;小鼠 GPR109A 上游 5′-CCCT TGCCGTGTGATGCT-3′, 下游 5′-ACCACGGTGAGGAAGATGATG-3′,熒光探針 6FAM-ATGTTGGCTATGAACCGACAGGGCA-BHQ;看家基因小鼠 GAPDH上游 5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′,下游 5′-GTCTTCTGG GTGGCAGTGATG-3′熒光探針6FAM-GGAA GGGCTCATGACCACAGTCCA-TAMRA。

1.5 細胞內(nèi)環(huán)磷腺苷測定

十二孔細胞培養(yǎng)板中的單層HepG2細胞用10 ng/mL LPS或鹽水孵育48h后,先用無血清的DMEM培養(yǎng)液清洗,然后用腺苷酸環(huán)化酶刺激劑福斯高林30 μ mol/L及磷酸二脂酶抑制劑IBMX 0.1mg/mL作用15 min。參照檢測說明,收集細胞裂解液,用酶聯(lián)免疫吸附法測定。

1.6 膽固醇外流試驗

實驗前1 d,取預鋪膠原酶I的二十四孔細胞板,以每孔1×105的密度將HepG2細胞種板。用含2 μ Ci/ml 3H標記的膽固醇和1%的FBS的DMEM培養(yǎng)液在37℃標記細胞24 h。隨后棄膽固醇孵育液,用無血清培養(yǎng)基洗板3次,再置細胞于含或不含 LXRα激動劑 TO901317的DMEM培養(yǎng)液中過夜。另外,LPS組細胞予以10 ng/mL的LPS孵育。細胞同步化后,加入含10 μ g/mL載脂蛋白A-I的膽固醇誘導流出液繼續(xù)孵育。24 h后,取細胞上清高速離心棄沉淀測液閃計數(shù)。用0.1 N的氫氧化鈉溶液裂解培養(yǎng)板中的細胞,并用液閃計數(shù)器計數(shù)。膽固醇外流率=外流液計數(shù)/(外流液計數(shù)+裂解液計數(shù))100%。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠GPR109A在巨噬細胞和肝臟細胞中的分布

煙酸受體在脂肪組織高表達,在巨噬細胞、肝細胞中的表達均低。為觀察生理狀態(tài)下肝細胞中煙酸受體的表達水平,作者收集了巨噬細胞株RAW264.7、J774,以及3種小鼠原代巨噬細胞的腹腔巨噬細胞、骨髓源性巨噬細胞、肝臟的Kupffer細胞,小鼠空腸組織以及小鼠原代肝細胞的cDNA,用定量PCR法檢測小鼠GPR109A的mRNA表達水平。結(jié)果提示除小鼠骨髓源性巨噬細胞外,小鼠腹腔巨噬細胞、肝臟Kupffer細胞、RAW264.7細胞、J774細胞中均有較高水平的GPR109A表達。Mac-2,又名半乳糖素-3(lectin-3),是巨噬細胞的標記基因,本研究中骨髓源性巨噬細胞有很強的Mac-2,但GPR109A的表達水平缺如;而小鼠腹腔巨噬細胞的Mac-2及GPR109A表達水平均很高。小鼠的空腸組織被用作陰性對照,既沒有檢測到Mac-2也沒有GPR109A表達。小鼠原代肝細胞中Mac-2的表達水平非常低,但仍有一定程度的GPR109A表達。

2.2 注射LPS后小鼠肝臟GPR109A基因的表達上調(diào)

文獻報道巨噬細胞在炎癥刺激時會上調(diào)GPR109A的表達[10],為觀察肝細胞中GPR109A的表達是否會受炎癥刺激而上調(diào),作者給小鼠注射了低劑量的脂多糖。實驗發(fā)現(xiàn)接受 LPS注射后兩小時,小鼠的肝臟組織中有大約700多倍的GPR109A。因為肝臟組織中有10%～15%的Kupffer細胞,一種原位的肝臟巨噬細胞,作者觀察到的GPR109A表達上調(diào)到底是源自肝臟組織中的Kupffer細胞,還是真的源自肝細胞自身。為此,注射過LPS的小鼠的原代肝細胞被新鮮分離,然后提取 RNA,做 RT-PCR。結(jié)果提示LPS刺激后肝細胞的GPR109A表達上調(diào)了600倍,略低于在肝臟組織的上調(diào)倍數(shù)。提示肝臟的肝細胞自身可以應(yīng)對炎癥反應(yīng)而上調(diào)GPR109A,而不單純是 Kupffer細胞應(yīng)對炎癥反應(yīng)后上調(diào)GPR109A。誘導型一氧化氮合酶(iNOS)和血漿淀粉樣蛋白A都是LPS刺激后肝臟組織炎癥反應(yīng)的下游基因,結(jié)果顯示無論是肝臟組織還是肝細胞中的iNOS與SAA表達都受到LPS的刺激表達水平明顯增高,提示LPS的注射有效。

2.3 LPS上調(diào)HepG2細胞GPR109A基因表達

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)可以促進在體的小鼠肝細胞中GPR109A的表達增加,這種反應(yīng)是否也存在于人肝細胞呢?作者用低劑量的 10 ng/mL LPS處理 HepG2細胞,發(fā)現(xiàn) LPS的下游基因SAA成千倍的增長,證明LPS的處理有效。同時,作者發(fā)現(xiàn)LPS處理12小時開始GPR109A的表達顯著增多,并且隨著孵育時間的延長而明顯增強。人的GPR109B和GPR81與GPR109A 3個基因高度同源,其中GPR109B與GPR109A更是分享了高達 96%的同源性,而GPR81也有60%的序列與 GPR109A相同。GPR109B和GPR81的表達是否也受炎癥應(yīng)答而上調(diào),尚不得而知。作者的結(jié)果表明,長時間的LPS處理也能上調(diào)GPR109B和GPR81的表達,只是其上調(diào)的倍數(shù)遠低于GPR109A。

2.4 LPS處理降低人肝臟細胞內(nèi)cAMP釋放

GPR109A作為一種抑制型G蛋白偶聯(lián)受體,活化后可以抑制細胞內(nèi)的cAMP釋放,從而抑制蛋白激酶A的活性。既然作者的研究發(fā)現(xiàn)炎癥應(yīng)激可以上調(diào)肝細胞中的GPR109A,作者又接著觀察小劑量長時間炎癥過程是否影響肝細胞內(nèi)cAMP的釋放。長時間LPS刺激使HeG細胞cAMP釋放明顯減少,這證明炎癥應(yīng)答時表達增多的GPR109A確為活化的抑制型G蛋白偶聯(lián)受體。

2.5 LPS處理降低人肝臟細胞膽固醇外流至apoA-I

肝細胞的GPR109A在炎癥過程中上調(diào),為進一步了解其在脂代謝尤其是新生HDL的形成中的作用,作者觀察了LPS刺激對肝細胞的膽固醇外流的影響。結(jié)果表明,長時間的LPS刺激對于靜息狀態(tài)下HepG2細胞的膽固醇外流并無影響,但是在LXRα路徑激活情況下的膽固醇外流至apoA-I明顯減少。

3 討 論

G蛋白偶聯(lián)受體GPR109B,GPR81與GPR109A高度同源,在人體內(nèi)都是由12號染色體上的基因所編碼[12]。近年這3個基因的內(nèi)源性配基相繼揭曉,GPR109A的內(nèi)源性配基是β-羥基丁酸[13],GPR109B的內(nèi)源性配基是3-羥基辛酸[14],GPR81的內(nèi)源性配基是乳酸[15]。3種酸都屬于羥基羧酸代謝物,所以它們也因此被重新命名為羥基羧酸(HCA)受體[16]。GPR109A和GPR81存在于大多數(shù)的哺乳類動物中,而GPR109B只在高級的靈長類動物中表達。這3種G蛋白偶聯(lián)受體都在脂肪細胞中存在,并且與抑制性G蛋白偶聯(lián)介導脂肪細胞的抗脂解效應(yīng)。2001年,在干擾素和腫瘤因子刺激的巨噬細胞中小鼠GPR109A第一次被克隆并命名為PUMAG(protein up-regulated in macrophages by IFN-γ)[10]。桿狀細菌李斯特菌感染可以誘導小鼠脾臟GPR109A的表達。人和大鼠的GPR109A隨后被克隆,同時證實為煙酸受體[6-8]。GPR109A不僅在脂肪細胞,還在各種免疫細胞包括中性粒細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、表皮朗罕氏細胞中有表達[17-19],但是在小鼠和人的B細胞、T細胞或者人的嗜酸性粒細胞中卻不表達[20]。與小鼠腹腔巨噬細胞、肝臟Kupffer細胞不同,在骨髓源性巨噬細胞中作者沒有檢測到GPR109A的表達,或許提示GPR109A的只表達在終末分化的中性粒細胞的后期。

HDL主要是由肝臟和小腸合成1。新生的HDL呈碟形,由磷脂、游離膽固醇和載脂蛋白(apo AI和apo AII)組成。新生的HDL顆粒密度高,其膽固醇含量相對較少,隨著膽固醇酯的進一步摻入,使HDL的密度降低而形成成熟的HDL。周圍細胞中的膽固醇在漿膜雙層上的分布是不對稱的,有核細胞中的膽固醇大多分布在漿膜的內(nèi)層上。周圍組織的膽固醇是以游離膽固醇的形式進行轉(zhuǎn)移的,膽固醇的外流可通過彌散或受體介導的方式進行。在受體介導的主動的膽固醇外流過程中,HDL與細胞上的高密度脂蛋白結(jié)合蛋白結(jié)合,激活蛋白C激酶介導的信號系統(tǒng)從而誘導膽固醇的外流,膽固醇從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移到細胞表面。ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子1(ABCA1)通過利用ATP參與將脂質(zhì)從細胞膜內(nèi)層移至外層,再與載脂蛋白A-I結(jié)合形成HDL,從而對膽固醇的外流進行調(diào)節(jié)。肝臟的ABCA1在新生HDL合成中起重要作用,而ABCA1的蛋白表達甚至活性都受cAMP的調(diào)節(jié)[21],因此當作者發(fā)現(xiàn)炎癥狀態(tài)下GPR109A大量上調(diào)而抑制細胞內(nèi)cAMP釋放時,作者聯(lián)想到其是否會進一步影響肝臟中游離膽固醇外流至載脂蛋白A-I。作者的實驗結(jié)果證明了作者的猜想,炎癥應(yīng)答時上調(diào)的GPR109A可以抑制新生HDL合成。結(jié)果也提示一些促炎癥病理狀態(tài)例如肥胖、胰島素抵抗等可能伴隨著肝細胞煙酸受體表達增強而導致的HDL數(shù)量減少。

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