王 瑞 ，展曉日 ，王 皎 ，曾昭武

（1.山西中醫(yī)學(xué)院中藥系，山西 太原 030024； 2.杭州師范大學(xué)生物醫(yī)藥與健康中心，浙江 杭州 310012）

桂枝湯是由桂枝、白芍、甘草、生姜、大棗五味藥物組成的復(fù)方，是解肌發(fā)汗、調(diào)和營(yíng)衛(wèi)的第一方，具有《傷寒雜病論》群方之冠的美稱。白芍為毛茛科植物芍藥的干燥根，其主要有效成分芍藥苷具有鎮(zhèn)靜、解痙、抗炎、抗應(yīng)激性潰瘍病、擴(kuò)張冠狀血管等多種藥理作用［1-2］。本研究將芍藥苷作為含量測(cè)定的指標(biāo)成分，通過高效液相色譜法測(cè)定白芍藥材及桂枝湯中芍藥苷的含量變化，探討桂枝湯配伍的合理性。

1 實(shí)驗(yàn)材料

CAMAG TLCSCANNER-3薄層掃描儀（瑞士CAMAG公司），硅膠G（青島海洋化工廠分廠），METTLER TOLEDO十萬(wàn)分之一電子分析天平，HANGPING-FA 2104萬(wàn)分之一電子分析天平。芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：0715-200211，純度>98%，中國(guó)藥品生物制品檢定所購(gòu)買）。桂枝、白芍、甘草均購(gòu)自北京同仁堂藥店，大棗、生姜為市售。其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件［3］與檢測(cè)方法

硅膠G薄層板，展開劑為氯仿-乙酸乙酯-甲醇-濃氨試液（8∶1∶4∶1），顯色劑為 5% 香草醛硫酸溶液，晾干，加熱顯色。檢測(cè)波長(zhǎng)為575 nm，參比波長(zhǎng)700 nm；柱溫：室溫。

2.2 供試品溶液的制備［4］

2.2.1 桂枝湯供試品溶液的制備 根據(jù)處方分別稱取桂枝、白芍、生姜各9 g，炙甘草6 g，大棗12枚（去核），精密稱定，加入10倍量的水350 mL，浸漬1 h，煎煮30 min，過濾；殘?jiān)尤?倍量的水280 mL再煎煮20 min，過濾，合并兩次濾液，水浴揮發(fā)至小體積，用蒸餾水定容至100 mL。精密吸取桂枝湯20 mL，用乙醚振搖提取3次，每次20 mL，棄去乙醚液，水溶液用水飽和的正丁醇萃取4次，每次20 mL；合并萃取液，用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次20 mL，棄去水液，正丁醇蒸干，殘?jiān)眉状级ㄈ葜? mL，作為桂枝湯供試品溶液。

2.2.2 白芍供試品溶液的制備 精密稱定白芍9 g，加水350 mL，浸漬1 h，煎煮30 min，過濾；殘?jiān)铀?80 mL再煎煮20 min，過濾，合并兩次濾液，水浴揮發(fā)至小體積，用蒸餾水定容至100 mL。精密吸取水煎液20 mL，用水飽和的正丁醇萃取4次，每次20 mL，合并萃取液，用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次20 mL，棄去水液，正丁醇蒸干，殘?jiān)眉状级ㄈ葜? mL，作為白芍供試品溶液。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取芍藥苷對(duì)照品適量，用甲醇溶解并配成每毫升含1.93 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.4 陰性供試品溶液的制備

稱取除白芍外的其他藥材，按“2.2.1”項(xiàng)下桂枝湯供試品溶液的方法制備陰性樣品溶液。

2.5 線性關(guān)系考察

用毛細(xì)管分別吸取對(duì)照品溶液 1 μL、2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL 點(diǎn)于同一硅膠 G 板上，照薄層色譜法（附錄 VIB）試驗(yàn)［5］，按上述白芍薄層層析條件展開，取出，晾干，顯色后，加熱至斑點(diǎn)清晰，立即用玻璃板覆蓋并封邊，掃描。以芍藥苷點(diǎn)樣量X（μg）為橫坐標(biāo)，斑點(diǎn)面積積分值Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=1 402.7X+1 076.8，r=0.999 8，結(jié)果表明，芍藥苷在1.93 μg～19.3 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.6 精密度實(shí)驗(yàn)

取同一份白芍供試品溶液，在同一塊薄層板上點(diǎn)6個(gè)點(diǎn)，均點(diǎn)樣4 μL，展開，取出，晾干，顯色后掃描測(cè)定后，加熱至斑點(diǎn)清晰，立即用玻璃板覆蓋并封邊，掃描芍藥苷斑點(diǎn)。峰面積的RSD=2.2%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

按處方稱取桂枝9 g，白芍9 g，炙甘草6 g，生姜 9 g，大棗 12枚（去核），精密稱定，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備桂枝湯供試品溶液，放置0 h，3 h，6 h，9 h，12 h，24 h后，按上述色譜條件進(jìn)行TLC分析，每次點(diǎn)樣4 μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算得白芍中芍藥苷含量為 1.24 mg/g，1.24 mg/g，1.33 mg/g，1.23 mg/g，1.29 mg/g，1.27 mg/g，RSD=3.0%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

按桂枝湯處方量稱取6份，精密稱定，照“2.2.1”項(xiàng)下方法制備。稱取白芍藥材6份，每份9 g，精密稱定，照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備。分別精密吸取上述溶液4 μL，依法測(cè)定，測(cè)得桂枝湯樣品溶液中芍藥苷含量分別為 1.24 mg/g，1.30 mg/g，1.27 mg/g，1.32 mg/g，1.23 mg/g，1.28 mg/g，RSD=2.7%。白芍供試液中芍藥苷含量分別為 0.95 mg/g，0.97 mg/g，0.92 mg/g，0.95 mg/g，0.98 mg/g，0.91 mg/g，RSD=2.9%。

2.9 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

取芍藥苷對(duì)照品適量，溶于甲醇中，制成濃度為10 mg/g芍藥苷對(duì)照品溶液。稱取白芍藥材6份，每份4.5 g，精密稱定，均加入上述對(duì)照品溶液0.3 mL，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，得白芍藥材加樣回收率供試品溶液。按桂枝湯處方量（白芍減半）稱取6份，精密稱定，均加入上述對(duì)照品溶液0.4 mL，照“2.2.1”項(xiàng)下方法制備，得桂枝湯加樣回收率供試品溶液。吸取上述供試品溶液4 μL，對(duì)照品溶液4 μL和6 μL，交叉點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，按上述薄層掃描條件測(cè)定，得白芍藥材中芍藥苷加樣回收率分別為99.8%，92.2%，93.1%，98.4%，96.3%，94.2%，RSD=3.2%；桂枝湯中芍藥苷的平均加樣回收率分別為 93.4%，96.2%，98.5%，96.8%，93.6%，99.4%，RSD=2.6%。

2.10 陰性干擾實(shí)驗(yàn)

移取白芍藥材溶液、桂枝湯樣品溶液、陰性樣品溶液和芍藥苷對(duì)照品溶液各4 μL，交叉點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，按照“2.1”項(xiàng)下薄層色譜條件展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸試液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。白芍藥材溶液和桂枝湯樣品溶液在與對(duì)照品相同的位置顯示相同顏色的斑點(diǎn)，陰性樣品溶液在與對(duì)照品相同的位置沒有斑點(diǎn)，不干擾樣品的測(cè)定。

2.11 樣品含量的測(cè)定

用毛細(xì)管吸取白芍供試品溶液4 μL，桂枝湯樣品溶液 4 μL，對(duì)照品溶液 4 μL 與 6 μL，分別交叉點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，按上述層析、掃描條件，用外標(biāo)兩點(diǎn)法測(cè)定供試品中芍藥苷含量。白芍藥材中芍藥苷的含量分別為 0.95 mg/g，0.93 mg/g，0.98 mg/g，0.91 mg/g，0.89 mg/g，0.94 mg/g，平均含量為 0.93 mg/g。桂枝湯中芍藥苷的含量分別為1.24 mg/g，1.30 mg/g，1.27 mg/g，1.32 mg/g，1.23 mg/g，1.28 mg/g，平均含量為1.27 mg/g。桂枝湯中芍藥苷的含量顯著大于白芍煎液中芍藥苷的含量（n=6，P<0.01），故桂枝湯配伍后對(duì)白芍中有效成分芍藥苷具有助溶作用，配伍有助于藥物有效成分的溶出。

3 討論

芍藥苷的提取方法有有機(jī)溶劑加熱回流提?。?］、超聲提?。?-9］和微波提?。?0］等，這些方法能有效地提取芍藥苷，但文中的樣品均為水煎液，先用乙醚除去脂溶性雜質(zhì)，然后用水飽和正丁醇萃取，最后用正丁醇飽和水除去水溶性雜質(zhì)，這樣可去除較多雜質(zhì)干擾?；厥章蕦?shí)驗(yàn)表明，該法對(duì)芍藥苷的提取效率較高，選擇性較強(qiáng)，重復(fù)性較好，可滿足分析要求。

白芍在中國(guó)有悠久的用藥歷史和堅(jiān)實(shí)的臨床基礎(chǔ)，常在方劑中配伍使用，幾乎不作為單方應(yīng)用。因此，文中考察了白芍配伍前、后芍藥苷煎出量的變化，結(jié)果表明，復(fù)方配伍的桂枝湯中芍藥苷的煎出量較白芍藥材單煎液明顯升高，從一個(gè)側(cè)面說明了復(fù)方配伍理論的合理性。

通過采用薄層掃描法測(cè)定白芍藥材和桂枝湯中芍藥苷的含量，分析芍藥苷在白芍單煎劑和桂枝湯中的含量變化，得出配伍后桂枝湯中芍藥苷的含量較白芍單煎液中芍藥苷的含量高，因此配伍有助于有效成分芍藥苷的溶出。

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