楊亞麗 吳 芳 楊瑞瑞 陜西省食品藥品檢驗(yàn)所 (西安 710061)

黃芩為唇形科植物黃芩 Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根 ,性苦寒,歸肺、膽、脾、大腸、小腸經(jīng)。有清熱燥濕,瀉火解毒,止血安胎之功效。用于濕溫、暑濕,胸悶嘔惡,濕熱痞滿,瀉痢,黃疸,肺熱咳嗽,高熱煩渴,癰腫瘡毒等癥,是我國(guó)中醫(yī)臨床常用大宗藥材品種之一。黃芩含有多種化學(xué)成分,目前從黃芩中提取并鑒定出結(jié)構(gòu)的黃酮類(lèi)成分已有十幾種,含量較高的成分有黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素。黃芩主產(chǎn)區(qū)為我國(guó)的西北地區(qū)、華北地區(qū)、東北地區(qū)。就品質(zhì)上而言,種源為山東和陜西的藥材綜合指標(biāo)較高。 2010版《中國(guó)藥典》規(guī)定黃芩采收期為春秋二季,但不同采收期對(duì)黃芩藥材化學(xué)成分及其質(zhì)量有無(wú)影響,目前尚無(wú)報(bào)道。我們對(duì)收集到陜西產(chǎn)的 20批樣品,以黃芩苷為指標(biāo),建立了陜西省不同采收期黃芩的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜,為黃芩藥材全面質(zhì)量控制提供可靠的科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters-Alliance2695-2487(G02SMT649M)高效液相色譜儀。

1.2 試藥 水為超純水,乙腈、甲醇為色譜純,其它試劑均為分析純。黃芩苷,批號(hào) 110736-200423)中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。黃芩樣品采自陜西省不同地區(qū),共 20批,其中 1～10批為春季采收,11～20批為秋季采收。經(jīng)陜西中醫(yī)學(xué)院王繼濤教授鑒定為唇形科植物黃芩 Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 選用 SUPELCO DiscoveryC18柱(250mm×4.6mm,5 μ m);乙腈 (A)20.25% 磷酸(B)-四氫呋喃(C)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫:0～14 m in(21%A-78%B-1%C),17 m in(28%A-71%B-1% C),25 m in(31% A-68% B-1% C),45～60 m in(39% A-60%B-1% C),65 m in(30% A-69%B-1%C),70 m in(21%A-78%B-1%C)。檢測(cè)波長(zhǎng) 274 nm;體積流量 1.0 mL/m in;柱溫 30℃;進(jìn)樣量 10 uL;理論板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算應(yīng)約為 2×105,與其他峰的分離度均大于 1.0。所有組分均在 70 m in內(nèi)被檢測(cè)完。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 取黃芩苷對(duì)照品適量,精密稱(chēng)定,加甲醇溶解并稀釋制成 0.1m g/mL的溶液,作為對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取黃芩藥材粉末(過(guò) 5號(hào)篩)0.2 g,精密稱(chēng)定,置 100 m L量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,稱(chēng)定重量,超聲提取 45 m in,取出,放冷,用甲醇補(bǔ)足重量,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液 2 mL置5 mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,微孔濾膜(0.45um)濾過(guò),即得供試液。

測(cè)定法:分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各 10 μL,注入液相色譜儀。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn):精密吸取同一份樣品溶液(No.10)10 μL,連續(xù)進(jìn)樣 5次,計(jì)錄 HPLC色譜圖。測(cè)得供試品溶液各共有峰相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于 3%,表明精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn):取同一批樣品(No.10)6份,按 2.3項(xiàng)方法制備供試品溶液,分別進(jìn)樣 10 μL,計(jì)錄HPLC色譜圖。測(cè)得供試品溶液各共有峰相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間的 RSD均小于 3%,表明方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn):精密吸取同一份黃芩(No.10)供試品溶液,分別在 0,2,4,6,8,10,12,24h進(jìn)樣10 μL,計(jì)錄 HPLC色譜圖。測(cè)得供試品溶液各共有峰相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間比值無(wú)明顯變化,RSD均小于 3%,表明供試品溶液在 24h內(nèi)穩(wěn)定。穩(wěn)定性良好。

2.5 指紋圖譜的建立與分析

2.5.1 指紋圖譜的制備:取春秋季采收的黃芩樣品各 10批,按 2.3項(xiàng)方法制備供試品溶液,分別進(jìn)樣10 μL,計(jì)錄 HPLC色譜圖。將藥材指紋圖譜導(dǎo)入中藥色譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件(2004 A版),設(shè)定匹配模板,進(jìn)行譜峰自動(dòng)匹配,并生成對(duì)照指紋圖譜,結(jié)果見(jiàn)圖 3～6。 20批樣品共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積范圍分別見(jiàn)表1、表2。

2.5.2 共有峰的確定:10批春季樣品生成的對(duì)照指紋圖譜,有 11個(gè)共有峰;10批秋季樣品生成的對(duì)照指紋圖譜,有 14個(gè)共有峰;通過(guò)與對(duì)照品對(duì)照,分別指認(rèn)春季 8號(hào)峰,秋季 11號(hào)峰為黃芩主要指標(biāo)成分黃芩苷。

2.5.3 指紋圖譜的相似度評(píng)價(jià):分別采用 SPSS軟件的相關(guān)系數(shù)法、夾角余弦法以及國(guó)家藥典委員會(huì)中藥色譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件(2004 A版),對(duì)不同采收期黃芩樣品進(jìn)行相似度計(jì)算,計(jì)算所有樣品的相似度。結(jié)果不同方法所得相似度結(jié)果趨于一致,秋季采收的黃芩樣品相似度明顯高于春季采收的樣品,說(shuō)明不同采收期的黃芩藥材所含化學(xué)成分有一定的差異。

3 討 論 3.1 在流動(dòng)相系統(tǒng)的選擇中,分別以乙腈-水、乙腈-0.25% 磷酸、甲醇-水、乙腈-0.25%磷酸-四氫呋喃作為流動(dòng)相,結(jié)果用乙腈-0.25% 磷酸-四氫呋喃梯度洗脫,分離效果最佳。用不同的檢測(cè)波長(zhǎng)檢測(cè)分析,274nm處指紋峰較多,響應(yīng)值均較大,且基線較平穩(wěn),有利于指紋圖譜的分析。故選擇 274nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 本實(shí)驗(yàn)比較了不同提取溶劑如 70%乙醇、50%甲醇、甲醇的不同提取方法的提取效果,以甲醇提取的總體效果為佳。采用甲醇提取,可將其不同成分完全表述。70% 乙醇雖可將黃芩苷提取更完全,但指紋圖譜只傾向于某幾個(gè)峰,甲醇提取黃芩苷的峰相對(duì)低些,但就指紋圖譜的整體性而言更合適一些。同時(shí)還考察了以甲醇為提取溶劑,不同提取時(shí)間(30、45、60 m in)的提取效果。結(jié)果表明,以甲醇為提取溶劑,超聲提取 45 m in,提取較完全,且方法穩(wěn)定、重現(xiàn)性好。

3.3 本實(shí)驗(yàn)用不同的數(shù)據(jù)處理方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,由得出的相似度結(jié)果可知,20個(gè)樣本間有較好的相關(guān)性,但又有區(qū)別。

3.4 秋季采收的黃芩樣品相似度明顯高于春季采收的樣品,說(shuō)明不同采收期的黃芩藥材所含化學(xué)成分有一定的差異。通過(guò)指紋圖譜對(duì)不同采收期黃芩藥材進(jìn)行綜合宏觀分析,有利于全面控制藥材質(zhì)量,促進(jìn)黃芩藥材及其制劑質(zhì)量控制的全面提高。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一)部.[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社.2005,211.

[2]Technical Requirement ofthe Fing erprint in Injection of Chinese Materia Medica(Tentative Standard)[中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)][S].2001.

[3]Zhang K R,Bi K S1Study on fingerprint of Rad ix Paeoniae Rubra by HPLC[J]1 Chin Trad it Herb Drugs(中草藥),2003,34(11):1048-1051.