甘 欣 ，魏臻武,2，武自念，楊 云，趙 艷

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院，甘肅 蘭州 730070； 2.揚州大學動物科學與技術學院，江蘇 揚州 225009)

栽培苜蓿(Medicagosativa) 是同源四倍體，常異花授粉植物，是一個雜合的持續(xù)分離的群體，且每個個體的遺傳基礎都不同[1]。在選育特異性狀的苜蓿新品種時，多代自交可以得到含有多葉性狀純合個體，提高育種的效率。而在自交常規(guī)育種下，存在著嚴重的自交衰退現(xiàn)象，導致合子胚未發(fā)育成熟就中途敗育，自交結實率僅為2.2%～6.6%[1-5]，給苜蓿自交系育種工作帶來很大困難。

隨著現(xiàn)代生物工程技術的發(fā)展，利用胚挽救技術，在合子胚敗育之前進行離體培養(yǎng)，使其發(fā)育成成熟的胚，最終得到完整的植株[6-9]。該技術已在小麥(Triticumaestivum)、無核葡萄(Vitisvinifera)、花生(Arachishypogaea)、棗(Ziziphusjujuba)、百合(Liliumbrownii)等植物的雜交育種和胚培養(yǎng)方面開展了相關研究[7-11]。在苜蓿研究方面，McCoy[12]成功應用胚珠培養(yǎng)技術獲得了苜蓿種間雜交后代的胚培苗。 Bauchan[13]分別對蝸牛苜蓿(M.scutellata)和紫花苜蓿進行了胚挽救的研究，觀察了苜蓿不同時期胚珠的發(fā)育過程。結果發(fā)現(xiàn)，苜蓿幼胚的發(fā)育時期以及不同的激素水平都是影響胚挽救效率的重要因素，并且得到了大量的胚挽救苗。這充分說明借助胚挽救技術進行苜蓿特異性狀自交系育種具有廣闊的前景。

本研究對苜蓿多葉性狀自交系的實生種胚進行離體培養(yǎng)，探討了不同取材時期、不同單株、不同濃度的6-BA(6-芐氨基嘌呤)和KT(激動素)對苜蓿胚挽救的影響，以期為苜蓿胚挽救育種提供依據(jù)，并為苜蓿特異性狀自交系結實率低等方面的研究提供有效的解決途徑。

1 材料與方法

1.1供試材料 從84個不同來源苜蓿品種(系)中，根據(jù)分子標記多態(tài)性和田間性狀，篩選600個優(yōu)良特異單株進行移栽，通過3年田間選擇，從中篩選多葉性狀表現(xiàn)優(yōu)良的單株自交，獲得多葉自交系。將自交后代S1于2007年9月種植于揚州大學實驗農(nóng)牧場，經(jīng)2年觀測從成活的80個單株中選取了3株多葉表達穩(wěn)定，且多葉率高的S1代單株。單株號為MFS5、MFS42、MFS46(表1)。

1.2試驗方法

1.2.1自交方法 苜蓿自交試驗于2009年5月14日在揚州大學實驗農(nóng)牧場進行，對3個自交S1代單株整株罩蚊帳隔離，選取健康枝條上的小花序，摘除已授粉和花序頂端未成熟的花蕾，將剩余小花剝蕾自交后用蠟紙紙袋套上，掛牌標記。每個單株分別做400個花序，授粉10 d后去袋。

1.2.2苜蓿敗育率調查 在自交授粉后40 d，對自交系3個單株進行敗育率調查[7,12-16]。隨機選取莢果100粒，重復3次，順莢果螺旋方向剖開，用鑷子剝出幼胚，凡幼胚干癟，皺縮或種殼內空的，皆視作敗育，并統(tǒng)計敗育率。

表1 3份苜蓿自交系試材的植物學特征

1.2.3材料滅菌與接種 從授粉后20 d開始，每隔5 d采集，將采集到的材料暫保存于4 ℃冰箱。接種前用自來水將莢果沖洗30 min，然后用70%乙醇浸潤30 s，無菌水沖洗3次，在無菌環(huán)境下用0.1%的升汞浸泡20 min，無菌水漂洗5次。用剪刀順莢果螺旋方向剪開，用手術刀和鑷子剝掉種皮，挑出幼胚接種到培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)皿接種12粒。

1.2.4苜蓿胚挽救最佳時期的選擇 從自交授粉后20 d開始，每隔5 d采集莢果，到授粉40 d結束。滅菌后，剝出幼胚，將其接種在MS+0.5 mg/L IAA+0.05 mg/L 6-BA基本培養(yǎng)基上，蔗糖30 g/L，瓊脂7 g/L，pH值5.8～6.1。每個材料接種10皿，12粒/皿。接種后將培養(yǎng)皿放入25 ℃的暗培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)3～5 d后轉入溫度為25 ℃、光強1 500～2 000 lx、光照時間16 h/d、濕度35%的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，2周后統(tǒng)計胚的萌發(fā)情況。

1.2.5苜蓿胚挽救激素水平設置 采集胚挽救最佳時期的材料，分別接種于10種培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基的配方如下：以MS+0.5 mg/L IAA，蔗糖為30 g/L，瓊脂7 g/L，pH值5.8～6.1為基本培養(yǎng)基。分別添加5個不同梯度水平的6-BA (0.01、0.03、0.05、0.07、0.09 mg/L)和5個不同梯度水平的KT(0.01、0.03、0.05、0.07、0.09 mg/L)于培養(yǎng)基中；每種培養(yǎng)基接種10皿，12粒/皿。接種后將培養(yǎng)皿放入25 ℃的暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d后轉入溫度為25 ℃、光強1 500～2 000 lx、光照時間16 h/d、濕度35%的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。

1.2.6幼胚愈傷組織的誘導及不定芽的分化 將萌動的苜蓿幼胚轉接到MS+2.0 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L 6-BA，蔗糖30 g/L，瓊脂6.5 g/L，pH值5.8～6.1的培養(yǎng)基上。接種后放入溫度為25 ℃、光強1 500～2 000 lx、光照時間16 h/d、濕度35%的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。20 d后調查愈傷組織的誘導率。從生長旺盛且較致密的愈傷組織中切取不同顏色和質地，直徑為1 cm的小塊接種于MS+1.0 mg/L KT+0.1 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA的分化培養(yǎng)基上光培養(yǎng)，調查愈傷組織分化率。

2 結果與分析

2.1參試材料的植物學差異 對多葉自交系單株進行植物學觀察發(fā)現(xiàn)，MFS5多葉性狀明顯，多葉率為93%，5～7片，7片葉居多，羽狀，花淺紫色，半直立。MFS42多葉性狀較為明顯，多葉率為58%，4～9片葉，7片葉較多，羽狀，匍匐，花紫色。MFS46多葉率為73%，4～5片，4片葉多，多為掌狀，半直立，生長后期易倒伏，花色黃紫色。其中以MFS5，多葉表達率最高。經(jīng)2年田間觀測表明，以上材料多葉率較高且多葉性狀均能穩(wěn)定表達，可用于多葉苜蓿自交系的繼續(xù)選育和雜交親本的配置，是自交系中較優(yōu)良的單株。

2.2敗育率的調查情況 苜蓿自交后胚的敗育機理相當復雜，不同基因型、生長條件以及成熟期都對胚敗育產(chǎn)生影響[14，17-18]。通過幼胚形態(tài)特征觀察發(fā)現(xiàn)，正常的幼胚飽滿，顏色多為鮮綠色或淡綠色；而敗育的幼胚一直處于干癟、體積較小的狀態(tài)，通常表現(xiàn)為褐色或黑色。結果表明，在授粉后40 d，苜蓿的敗育率達到最高值。參試材料中，MFS5單株的敗育率為28.84%；MFS42單株的敗育率為43.26%；敗育率最高的材料為MFS46單株，達40.67%。

2.3不同取材時期對胚挽救的影響 為進一步確定多葉苜蓿自交系幼胚挽救的最佳取樣時期，從授粉后20～40 d，每隔5 d取幼胚進行離體培養(yǎng)。培養(yǎng)結果顯示，3個多葉苜蓿自交系單株在不同取材時期幼胚均能萌發(fā)，但不同時期的幼胚萌發(fā)差異較大(圖1)。采集授粉后20 d的材料褐化比較嚴重，萌發(fā)率較低，平均萌發(fā)率為28.09%；授粉后30 d接種，各材料幼胚萌發(fā)率均達到最高值，平均為46.71%，明顯高于其他各取材時期。此時進行胚挽救培養(yǎng)可以獲得最佳效果；授粉后40 d胚挽救效率最低，萌發(fā)率僅為12.16%，此時的胚處于綠色狀態(tài)，很難啟動萌發(fā)，大部分已處于生理成熟期。綜合分析，授粉后30 d進行胚挽救培養(yǎng)，胚的萌發(fā)率達到最高值，且此時接種胚不易出現(xiàn)褐化，相對其他時期萌發(fā)啟動早，約3～4 d后即可萌發(fā)，幼胚呈深綠色，為最佳取材時期。

圖1 不同取樣時間對苜蓿胚挽救萌發(fā)率的影響

2.4不同激素水平對幼胚挽救的影響 分別取3個自交單株在授粉后30 d的幼胚，接種于10種激素水平組合下的培養(yǎng)基上。以MS為基本培養(yǎng)基，在吲哚乙酸(IAA)保持0.5 mg/L不變的情況下，附加不同濃度的KT、6-BA 組合研究激素對苜蓿幼胚萌發(fā)的影響。

2.4.1細胞分裂素KT對幼胚萌發(fā)的效應 在不同KT質量濃度下，3個苜蓿自交單株的幼胚都能萌發(fā)。當KT質量濃度為0.01～0.03 mg/L時，3份材料的胚萌發(fā)率都隨著濃度的升高而增加。當KT為0.03 mg/L時，各材料胚萌發(fā)率均達到最大值，分別為MFS5單株 40.13%，MFS42單株38.5%，MFS46單株37.2%；但當KT質量濃度增加到大于0.03 mg/L時，萌發(fā)率開始下降，0.03～0.09 mg/L時，幼胚萌發(fā)率與KT質量濃度的增加成反比。KT質量濃度為0.09 mg/L時，3份材料萌發(fā)率都達到不同程度的最低值，其中MFS5單株的萌發(fā)率最低，僅為15.42%(圖2)。

圖2 不同質量濃度KT對苜蓿胚挽救萌發(fā)率的影響

2.4.2細胞分裂素6-BA對苜蓿幼胚萌發(fā)的效應 在6-BA濃度梯度下，各材料也都能萌發(fā)。0.01～0.07 mg/L時，3份材料幼胚萌發(fā)率與6-BA質量濃度的增加成正比。在0.01 mg/L時，各材料萌發(fā)率均為所有處理的最低值，MFS5單株16.63%，MFS42單株17.3%，MFS 46單株18.23%。當6-BA質量濃度達到0.07 mg/L時，各個材料均達到各自萌發(fā)率的最大值，MFS5單株53.34%，MFS42單株46.53%，MFS46單株43.37%(圖3)。但當6-BA質量濃度高于0.07 mg/L，6-BA對萌發(fā)率逐漸出現(xiàn)抑制作用。萌發(fā)率隨著6-BA質量濃度的增加而逐漸降低。且當6-BA質量濃度為0.01 mg/L時，3個材料的幼胚都發(fā)育遲緩，MFS5單株接種7 d后才出現(xiàn)萌發(fā)，并且胚萌發(fā)后出現(xiàn)生長停滯的現(xiàn)象。

圖3 不同質量濃度6-BA對苜蓿胚挽救萌發(fā)率的影響

對比6-BA和KT的結果發(fā)現(xiàn)，對于胚萌發(fā)添加6-BA要優(yōu)于添加KT。苜蓿幼胚培養(yǎng)的最佳組合為：MS+0.5 mg/L IAA +0.07 mg/L 6-BA，蔗糖30 g/L，瓊脂7 g/L，pH值5.8～6.1。

2.5幼胚愈傷組織的誘導及不定芽的分化 將萌動的幼胚轉入誘導愈傷培養(yǎng)基上，20 d后發(fā)現(xiàn)卷曲的子葉、葉緣及葉背處都形成愈傷組織，其愈傷組織結構大多呈現(xiàn)為淺黃色致密團狀，還有少數(shù)膨松水漬狀和白色沙粒狀等，20 d后統(tǒng)計，愈傷平均誘導率分別為MFS5 91.77%、MFS42 80.34%、MFS46 83.85%。然后將形成的愈傷組織每15～18 d繼代培養(yǎng)，等長到愈傷直徑為1 cm左右時轉入分化培養(yǎng)基上，統(tǒng)計愈傷組織分化率以MFS5最高為88.89%，其次為MFS46 87.58%，MFS42較低為77.92%。

3 討論

苜蓿胚敗育是一個極其復雜的生物學過程，苜蓿自花授粉后，經(jīng)雙受精作用而形成的合子和胚胎在發(fā)育過程中會出現(xiàn)夭亡的現(xiàn)象，其敗育的比率高于異花授粉[1,19]。關于苜蓿胚胎發(fā)育過程和敗育機理前人已有報道，早在1935年，Cooper[20]第1次對苜蓿的幼胚發(fā)育過程進行了描述。Rosellini等[18]分別對9個苜蓿群體的每個單株的胚珠敗育情況進行調查，發(fā)現(xiàn)苜蓿的胚珠敗育率為4%～26%。金洪等[15]對敖漢苜蓿(M.sativacv.‘Aohan’)授粉受精及幼胚的發(fā)育過程進行研究，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過受精作用幼胚細胞開始分裂分化，到第22天便形成了具有幼胚根、幼胚軸、幼胚芽和子葉的完整幼胚。幼胚的整個形成過程可分為3個階段：球狀幼胚形成期、子葉形成期、幼胚各部分發(fā)育成熟期。導致自交敗育的原因，除與兩性器官的不親和或不相適應有關外，也可能是一種近親繁殖效應的結果[1]。紫花苜蓿自交結實率的高低就主要取決于它們各自近親繁殖的程度，植物材料雜合性降低也是造成受精后合子或胚珠敗育的原因之一[21]。本研究對多葉苜蓿自交系授粉后40 d進行胚敗育率調查得出自交系單株平均胚敗育率為37.59%，與前人研究的苜蓿自交受精后胚珠敗育的百分率為34.4%[1]的結論相近。

苜蓿的敗育時期，確定胚接種的最佳取材時期是決定苜蓿胚挽救能否成功的前提條件。苜蓿自花不孕有一個特點，即幼胚自花受精后，種子敗育的頻率很高[1]。Bauchan[13]對苜蓿胚珠發(fā)育過程以及接種時間的研究表明，當紫花苜蓿胚珠發(fā)育為心形胚期(授粉后8～12 d)和魚雷形胚期(授粉后12～16 d)時，生長最好，萌發(fā)率為31%。所以接種時期太早，胚尚處于發(fā)育早期，很難培養(yǎng)成功；接種時間太晚，胚的發(fā)育率降低，甚至會因敗育而導致試驗失敗。本研究對于3個自交單株的胚挽救過程中發(fā)現(xiàn)，其幼胚胚齡在自交授粉后30 d胚的萌發(fā)率最高，為最佳取材時期。此時各個單株萌發(fā)率都比較高。

McCoy[12,16]研究了多年生苜蓿及一年生苜蓿雜交胚珠挽救技術，發(fā)現(xiàn)基本培養(yǎng)基為SH效果較好。Bauchan[13]對蝸牛苜蓿和紫花苜蓿胚挽救，證明MS和SH培養(yǎng)基適合于胚挽救，還研究了不同激素組合對于苜蓿胚珠萌發(fā)的影響；試驗證明添加0.05 mg/L IAA和0.05 mg/L 6-BA在MS中對胚珠萌發(fā)最為有利。從本研究可以看出，在MS培養(yǎng)基中，當IAA的質量濃度一定時(0.5 mg/L)，分別加入了不同質量濃度水平的6-BA和KT，對苜蓿胚挽救效力進行比較，添加6-BA的培養(yǎng)效果要比添加KT好，結果培養(yǎng)基的最佳激素質量濃度配比是：IAA 0.5 mg/L，6-BA 0.07 mg/L。培養(yǎng)基在幼胚生長發(fā)育過程中提供其所需的碳源和營養(yǎng)物質，而激素主要作用是調節(jié)滲透壓[22]。IAA 0.5 mg/L，6-BA 0.07 mg/L較其他不同激素組合效果好的原因，可能是能夠更好的提供苜蓿幼胚生長發(fā)育所需的滲透壓。

在促進萌發(fā)過程中，萌發(fā)的幼苗應及時轉入增殖分化培養(yǎng)基中才能防止褐化，愈傷組織在增殖過程中生長良好，70～90 d后產(chǎn)生膨松帶有綠色芽點的愈傷組織，最終分化成苗。進一步提高分化率的同時縮短愈傷組織分化時間是有待繼續(xù)研究的問題。

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