齊芬芳，冉雪琴，王嘉福，

(1.貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)工程省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽550025； 2.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽550025)

腺苷酸激酶(adenylate kinase，ADK)是生物體內(nèi)一種重要的核苷酸激酶，屬于磷酸果糖激酶B家族[1-2]。主要催化ADP的生成，反應(yīng)式為AMP + Mg2+ATP?ADP + Mg2+ADP。腺苷酸激酶廣泛存在于微生物、植物以及動(dòng)物體內(nèi)。所有腺苷酸激酶由3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成：CORE、AMPbd(AMP-binding subdomain)和LID(ATP-binding subdomain)結(jié)構(gòu)域。根據(jù)LID結(jié)構(gòu)域的長度將腺苷酸激酶分為長亞型和短亞型。底物分子與腺苷酸激酶結(jié)合后LID結(jié)構(gòu)域發(fā)生很大變化，并覆蓋整個(gè)活性位點(diǎn)，保護(hù)Mg2+ATP/AMP和酶形成的三元復(fù)合體，協(xié)助磷?；霓D(zhuǎn)移和防水解[3]。腺苷酸激酶以ATP或GTP作為磷酸根的供體，維持細(xì)胞中3種腺苷酸的正常水平，對(duì)能量代謝和酶活性的調(diào)節(jié)起重要作用[4]。本研究中，施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)75為貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)工程省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離到的一株有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌，能以毒死蜱作為唯一碳源生長。ADK在需要高水平ATP合成和利用的細(xì)胞中大量存在并參與細(xì)胞中的能量代謝和核苷酸代謝，低等生物要應(yīng)對(duì)多變的外界環(huán)境以及激烈的生存競爭，必然要求高度的腺苷酸激酶活性用以維持體內(nèi)的能量代謝平衡。而關(guān)于農(nóng)藥降解菌中的腺苷酸激酶基因鮮有報(bào)道。本研究以一株毒死蜱降解菌75為研究材料，克隆ADK基因并對(duì)其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行分析，以期為后續(xù)的研究奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來源 施氏假單胞菌75為貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)工程省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離的毒死蜱降解菌[5]。

1.1.2主要試劑 T4DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、載體pMD18-T為TaKaRa公司產(chǎn)品；DL2000 DNA Marker和質(zhì)粒提取試劑盒為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品，DNA片段膠回收試劑盒由Omega公司生產(chǎn)。引物由上海捷瑞生物技術(shù)有限公司合成，核苷酸序列的測定工作由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成。大腸桿菌(Escherichiacoli)TG1為貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)工程省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2方法

1.2.1基因組DNA的提取 施氏假單胞菌75單菌落接種于液體LB培養(yǎng)基，37℃ 120 r/min條件下震蕩培養(yǎng)過夜，取1.5 mL培養(yǎng)物12 000 r/min離心2 min，去上清。沉淀中加入400 μL的TE緩沖液，反復(fù)吹打使之懸浮，加入80 μL溶菌酶(100 mg/mL)，混勻，于37℃溫育1 h。加入100 μL 5 mol/L NaCl，充分混勻，再加入600 μL裂解液，混勻，65℃溫育10 min，12 000 r/min離心2 min，取上清，加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提2次，12 000 r/min離心5 min，取上清加入0.8倍體積的異丙醇，稍加離心沉淀基因組DNA，200 μL的70%乙醇洗滌沉淀，離心棄乙醇，干燥后溶于40 μL TE緩沖液(含25 ng/mL RNaseA)中，0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2ADK基因的擴(kuò)增及克隆 根據(jù)NCBI中已經(jīng)報(bào)道的假單胞菌屬ADK基因的序列，應(yīng)用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，正向引物P1：5′-CGATAGACCTTTTCGGGACGGCTTGT-3′；反向引物P2：5′-TGATCAGCTCAGGGCAGCAAAGACCT-3′。以細(xì)菌基因組為模板進(jìn)行擴(kuò)增，預(yù)期擴(kuò)增片段施氏假單胞菌75 ADK基因(以下均簡稱ADK75)約為810 bp。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 s，58℃退火35 s，72℃延伸50 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，切下含目的片段的膠條，用膠回收試劑盒回收目的片段，16℃下與pMD18-T載體連接過夜，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-T-ADK，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌 TG1，涂布于IPTG和X-gal的氨芐青霉素瓊脂平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。挑取白色單菌落，經(jīng)菌落PCR、質(zhì)粒提取以及質(zhì)粒PCR，鑒定為陽性的克隆子測定核苷酸序列。

1.2.3ADK基因序列分析 據(jù)ADK75核苷酸序列利用DNAstar推導(dǎo)出氨基酸序列；經(jīng)GenBank進(jìn)行核苷酸、氨基酸序列相似性比對(duì)，確定基因的開放讀碼框(open reading frame，ORF)，用瑞士生物信息學(xué)研究所的蛋白分析系統(tǒng)(Expasy protein analysis system)對(duì)目的基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，預(yù)測ADK75的理化性質(zhì)。應(yīng)用Clustal X程序進(jìn)行完全比對(duì)，以MEGA 4.0軟件選擇Neighbor-Joining法分析分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(重復(fù)1 000次)。通過SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)在線分析施氏假單胞菌ADK75蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。施氏假單胞菌ADK75基因核苷酸序列已在NCBI上登錄，接收號(hào)為HQ586947。

2 結(jié)果

2.1ADK75基因的克隆 以施氏假單胞菌75基因組DNA為模板，經(jīng)特異性引物擴(kuò)增，獲得810 bp的DNA片段，與預(yù)期大小相符(圖1)。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，與pMD18-T載體相連，經(jīng)菌落PCR及質(zhì)粒提取鑒定陽性克隆子，獲得陽性克隆pMD18-T-ADK。

圖1 ADK75基因片段的PCR擴(kuò)增

2.2ADK75基因序列分析 將測定的810 bp的DNA堿基序列與已知序列進(jìn)行比對(duì)，810 bp片段中包含648 bp的腺苷酸激酶基因，并具有完整的ORF，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA，共編碼215個(gè)氨基酸。經(jīng)Expasy軟件分析，編碼蛋白的分子量為23 191.3，等電點(diǎn)5.61。

與已知序列相比較，ADK75與施氏假單胞菌A1501(ABP80394.1)的同源性最高，核苷酸序列只有3個(gè)堿基差異，導(dǎo)致3個(gè)氨基酸改變，核苷酸同源性高達(dá)99.5%。

與假單胞菌屬其他ADK蛋白相比，同源性為77.2%～99.1%(圖2)。AMPbd結(jié)構(gòu)域和LID結(jié)構(gòu)域是腺苷酸激酶中兩個(gè)重要的功能區(qū)域。在AMPbd結(jié)構(gòu)域內(nèi)，施氏假單胞菌A1501與ADK75的氨基酸是一致的，但與其他的ADK蛋白在該區(qū)域的氨基酸差異數(shù)為3～13個(gè)。在LID結(jié)構(gòu)域內(nèi)，施氏假單胞菌A1501與ADK75的僅為第142位的絲氨酸變成異亮氨酸，而其他的ADK蛋白與ADK75的差異數(shù)為5～16個(gè)。推測這些氨基酸的不同可能與施氏假單胞菌75以毒死蜱為唯一碳源生長的特性有關(guān)。

圖2 施氏假單胞菌75與其他假單胞菌的氨基酸序列比較

以施氏假單胞菌75中ADK基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行BLASTp比對(duì)，獲得100條細(xì)菌來源的ADK基因序列，依據(jù)這些序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，若以自舉支持率15%為分界線，可將這100個(gè)基因歸為兩大類，假單胞菌屬屬于第一大類，第二大類包括少數(shù)變形菌門細(xì)菌屬及不動(dòng)細(xì)菌屬。以自舉支持率66%為分界線時(shí)，100個(gè)細(xì)菌ADK基因可分為13大類，假單胞菌屬依然歸為一類。從已知假單胞菌屬的7種ADK基因序列各選取一個(gè)為代表，另外選取2個(gè)碳酸鈣不動(dòng)桿菌(Acinetobactercalcoaceticus)RUH2202與空氣濾器水棲菌(Enhydrobacteraerosaccus)AK60作為外源，采用MEGA4.0中的Neighbor-Joining方法，與ADK75進(jìn)行聚類分析(圖3)。結(jié)果顯示，施氏假單胞菌75的ADK基因與施氏假單胞菌A1501分為一支，與同屬的惡臭假單胞菌(P.putide)GB-1及蟲媒假單胞菌(P.entomophila)L48的相應(yīng)基因有一定的距離。

以類鼻疽伯克霍爾德菌(Burkholderiapseudomallei)的ADK蛋白晶體結(jié)構(gòu)(pdb: 3gmtB)為模板，經(jīng)SWISS-MODEL在線分析施氏假單胞菌75編碼的ADK蛋白，構(gòu)建了ADK75蛋白的三維結(jié)構(gòu)(圖4)，其中包含9個(gè)β片層、8個(gè)α螺旋，含AMP結(jié)合位點(diǎn)和ATP-AMP(Ap5A) 結(jié)合位點(diǎn)，具有典型的ADK蛋白的分子特征[6-7]。三維結(jié)構(gòu)建模顯示，ADK75可以分為明顯的3個(gè)結(jié)構(gòu)域，CORE結(jié)構(gòu)域、LID結(jié)構(gòu)域和AMPbd結(jié)構(gòu)域。

圖3 施氏假單胞菌75 ADK基因氨基酸序列的聚類分析

圖4 ADK75三維結(jié)構(gòu)圖

3 討論

腺苷酸激酶作為維持腺苷酸代謝平衡的生物酶，為細(xì)胞提供了一個(gè)有效的磷酸傳遞，在生物體內(nèi)起著重要的作用。腺苷酸激酶ADK遺傳缺陷會(huì)導(dǎo)致非球型紅細(xì)胞溶血性貧血癥；大腸埃希菌ADK結(jié)構(gòu)基因的損傷可引起致死突變[7]；此外，ADK基因還可能在細(xì)胞凋亡中扮演著重要的角色[8]；在變鉛青鏈霉菌(Streptomyceslividans)中，腺苷酸激酶失活會(huì)導(dǎo)致孢子形成和放線紫紅素的生物合成受阻[9]，提示腺苷酸激酶一方面作為細(xì)胞中能量平衡的維持者，同時(shí)也參與大分子的合成或分解代謝；結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)中腺苷酸激酶不僅可以催化腺苷酸的磷酸化，還能催化腺苷酸的同源物2-甲基腺苷酸的磷酸化[10]，說明腺苷酸激酶作用的底物并不是單一的。目前還不清楚腺苷酸激酶是否可以作為磷酸根的供體參與毒死蜱的降解，但生物體內(nèi)的代謝是一個(gè)復(fù)雜的過程，任何完整的生物代謝都不是一種酶的單一作用可以完成。因此，對(duì)該基因的研究有利于了解腺苷酸激酶在有機(jī)磷農(nóng)藥降解中所扮演的角色。

ADK75基因在假單胞菌屬中相對(duì)保守，三維結(jié)構(gòu)建模顯示其具有典型的ADK蛋白的分子特征，而在AMPbd結(jié)構(gòu)域與LID結(jié)構(gòu)域內(nèi)存在的氨基酸差異說明該腺苷酸激酶在與磷酸根的結(jié)合及傳遞過程中也可能與其他非農(nóng)藥降解的假單胞菌的腺苷酸激酶有所不同。進(jìn)一步研究施氏假單胞菌75降解毒死蜱過程中腺苷酸激酶基因的表達(dá)量及其活性變化，將有助于有機(jī)磷農(nóng)藥解毒機(jī)理的研究。

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