宋 爽 宋士軍 張 翼 于 雷 趙晗潔 吳 嬋

慢性間歇性低壓低氧（chronic intermittent hypo?baric hypoxia，CIHH）是指一定時(shí)間間斷地暴露于低壓低氧環(huán)境,而其余時(shí)間處于常壓常氧環(huán)境。研究表明，CIHH可對(duì)抗缺血/再灌注引起的心肌損傷，并具有抗心律失常作用[1]。也有報(bào)道CIHH可以改變受體的反應(yīng)性[2]，CIHH有望作為一種治療手段用于臨床。丹皮酚（牡丹酚，paeonol，Pae）是中藥牡丹皮和徐長(zhǎng)卿中的主要有效成分，具有鎮(zhèn)靜、抗炎、抗菌、抗腦梗死、抗糖尿病和抗腫瘤等多種藥理作用。常用于治療口腔潰瘍、胃病、肝炎、胰腺炎、腸炎、急性闌尾炎等消化系統(tǒng)疾病[3]。CIHH和丹皮酚對(duì)消化道平滑肌收縮活動(dòng)的影響均少見報(bào)道。本研究旨在觀察CIHH處理前后，丹皮酚對(duì)大鼠回腸平滑肌的作用及作用機(jī)制的異同點(diǎn)，為臨床上應(yīng)用CIHH和丹皮酚提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 藥品及儀器 丹皮酚購(gòu)自Alfa Aesar公司，使用時(shí)用75%乙醇溶解；心得安（propranolol）、阿托品（Atropine）、左旋硝基精氨酸甲酯（NG-nitro-L-argininemethylester，L-NAME）、格列苯脲（glibenclamide，Gli）和乙酰膽堿（Acetylcholine，ACh）均購(gòu)自Sigma公司；吲哚美辛（Indomethacin，Indo）購(gòu)自Calbiochem公司。其余藥物均為國(guó)產(chǎn)分析純。Krebs液（mmol/L）：NaCl 118.0，KCl 4.7,CaCl22.5，MgSO41.2，NaHCO325.0，KH2PO41.2,葡萄糖 11.0，pH 7.4。無(wú)鈣Krebs液不加Ca?Cl2。SQG-4四腔器官浴槽系統(tǒng)（成都儀器廠生產(chǎn)），HSS-1型恒溫浴槽（成都儀器廠生產(chǎn)），BL-420E+生物功能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司生產(chǎn)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Sprague-Dawlay(SD)大鼠48只，清潔級(jí)，250~300 g，雌雄兼有，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：1001002，許可證號(hào)：CXK（冀）2008-1-003。

1.3 大鼠離體回腸標(biāo)本制備 大鼠實(shí)驗(yàn)前24 h禁食，自由飲水，腹腔注射戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉，迅速開腹,從回盲部取出末端回腸6~7 cm，用Krebs液沖洗內(nèi)容物，然后將其剪成約1 cm的腸段備用。將腸段置于平滑肌槽內(nèi)用Krebs液浸浴，溫度調(diào)節(jié)為（37.0±0.5）℃恒溫,持續(xù)通入95%O2+5%CO2混合氣體；腸段通過張力換能器與BL-420E+生物功能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)連接并記錄收縮活動(dòng)，加前負(fù)荷1.0 g，平衡1 h，每20 min換液1次，待腸段自主收縮活動(dòng)穩(wěn)定后開始加藥。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 48只大鼠隨機(jī)分為CIHH組和正常氧（CON）組，每組24只，每只大鼠可取得回腸段5~6段，每組動(dòng)物中的每個(gè)腸段均來(lái)自不同的大鼠；CIHH組置于低壓氧艙接受28 d模擬5 000 m海拔高度的低壓低氧處理，每日6 h，自由食水，每周監(jiān)測(cè)體質(zhì)量變化。CON組除不接受慢性低壓低氧處理之外，其余與CIHH組動(dòng)物相同。

1.4.1 CIHH對(duì)丹皮酚抑制大鼠回腸平滑肌收縮活動(dòng)的影響 在CON和CIHH組中隨機(jī)抽取不同大鼠的1個(gè)腸段，8個(gè)腸段為一小組，CON和CIHH組各分為丹皮酚組和對(duì)照組，丹皮酚組以5 min為間隔加入丹皮酚，使灌流槽Krebs液中丹皮酚累計(jì)濃度分別為20、40、80、160、320和640 mg/L。對(duì)照組加入與丹皮酚等體積的75%乙醇。記錄各時(shí)間點(diǎn)收縮活動(dòng)的幅度、頻率和張力，并計(jì)算活動(dòng)力（活動(dòng)力=幅度×頻率）[4]。將各指標(biāo)換算成占給藥前相對(duì)應(yīng)指標(biāo)的百分?jǐn)?shù)。以活動(dòng)力為指標(biāo)，用Logit法[5]計(jì)算CON和CIHH組的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.4.2 回腸平滑肌幾種與鈣有關(guān)的收縮活動(dòng)的測(cè)定 分組方法同1.4.1丹皮酚組加入150 mg/L丹皮酚，對(duì)照組加入等體積乙醇。對(duì)ACh引起的細(xì)胞內(nèi)Ca2+和外Ca2+性收縮的影響參照文獻(xiàn)[6]的方法進(jìn)行測(cè)定。參照文獻(xiàn)[7]的方法分別測(cè)定庫(kù)容性鈣通道開放引起的收縮（SOCE誘發(fā)的收縮）和高K+誘發(fā)的電壓門控鈣通道開放引起的收縮。

1.4.3 各種藥物對(duì)丹皮酚作用的影響 在CON和CIHH組中隨機(jī)抽取不同大鼠的1個(gè)腸段，8個(gè)腸段為一小組，CON和CIHH組各分為對(duì)照組、心得安組、L-NAME組、格列苯脲組和吲哚美辛組，待腸段收縮活動(dòng)穩(wěn)定后，各組分別加入蒸餾水、心得安10 μmol/L、L-NAME 0.3 mmol/L、格列苯脲5 μmol/L和吲哚美辛10 μmol/L，10 min后加入丹皮酚150 mg/L，記錄收縮幅度并計(jì)算占給藥前收縮幅度的百分?jǐn)?shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)分析均由SPSS 13.0完成。用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x ±s）的形式表示，兩組間均值比較應(yīng)用t檢驗(yàn)，多組間均值比較應(yīng)用單因素方差分析和Dunnett-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 CIHH對(duì)丹皮酚抑制大鼠回腸平滑肌收縮活動(dòng)的影響 丹皮酚從幅度、頻率、張力和活動(dòng)力方面均顯著抑制CON和CIHH大鼠回腸平滑肌的收縮活動(dòng)。與對(duì)照組相比丹皮酚多個(gè)劑量在幅度、頻率、張力和活動(dòng)力方面的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），見表1、2。以活動(dòng)力為指標(biāo)計(jì)算IC50分別為65.13 mg/L和135.74 mg/L。CIHH明顯減弱了丹皮酚對(duì)大鼠離體回腸的抑制作用，與CON相比，當(dāng)?shù)てし觿┝繛?0~640 mg/L時(shí)，在幅度和活動(dòng)力方面差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），見表3。

2.2 丹皮酚對(duì)大鼠回腸平滑肌幾種與鈣有關(guān)的收縮活動(dòng)的影響 在CON，丹皮酚顯著抑制了ACh引起的細(xì)胞內(nèi)外Ca2+性收縮、SOCE誘發(fā)的收縮和高K+誘發(fā)的收縮，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在CIHH，丹皮酚顯著抑制了ACh引起的細(xì)胞外Ca2+性收縮和高K+誘發(fā)的的收縮，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；而對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣性收縮和SOCE誘發(fā)的收縮無(wú)顯著影響（P>0.05），見表4。

2.3 各種藥物對(duì)丹皮酚作用的結(jié)果 在CON，心得安組、L-NAME組和吲哚美辛組可部分阻斷丹皮酚對(duì)回腸平滑肌收縮幅度的抑制作用，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表5，而格列苯脲組對(duì)丹皮酚的作用無(wú)影響（P>0.05）。在CIHH，L-NAME組和吲哚美辛組可部分阻斷丹皮酚對(duì)回腸平滑肌收縮幅度的抑制作用，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而心得安組和格列苯脲組對(duì)丹皮酚的作用無(wú)顯著影響（P>0.05），見表5。

表1 丹皮酚對(duì)CON大鼠回腸自發(fā)收縮活動(dòng)的影響 （n=8，%，x ±s）

表2 丹皮酚對(duì)CIHH大鼠回腸自發(fā)收縮活動(dòng)的影響 （n=8，%，x ±s）

表3 丹皮酚對(duì)CIHH大鼠回腸平滑肌收縮活動(dòng)影響的統(tǒng)計(jì)量 （t）

表4 丹皮酚對(duì)大鼠回腸平滑肌幾種與鈣有關(guān)的收縮活動(dòng)的影響 （n=8，x ±s，%）

3 討論

本研究結(jié)果表明，丹皮酚從幅度、頻率、張力和活動(dòng)力4個(gè)方面抑制了大鼠離體回腸的收縮活動(dòng)，CIHH預(yù)處理后顯著減弱了丹皮酚對(duì)大鼠離體回腸的抑制作用。

表5 各種藥物對(duì)丹皮酚作用后回腸平滑肌收縮幅度的影響 （n=8，x ±s，%）

消化道平滑肌細(xì)胞膜上存在著電壓操縱性鈣通道（voltage-operated Ca2+channel，VOCC）[7]，高鉀可使膜電位去極化，誘導(dǎo)VOCC開放而引起平滑肌收縮。丹皮酚抑制了正常氧和CIHH大鼠高鉀誘導(dǎo)的回腸平滑肌收縮，提示丹皮酚抑制回腸收縮的機(jī)制之一是抑制了VOCC的開放。

鈣庫(kù)操縱性鈣通道（store-operated Ca2+channel，SOCC）屬于受體操縱性鈣通道的一種，SOCC主要由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+量調(diào)控，在內(nèi)鈣耗竭情況下打開SOCC，進(jìn)而導(dǎo)致平滑肌收縮[7]；丹皮酚在內(nèi)鈣耗竭、M受體被阻斷的情況可以抑制正常氧大鼠回腸的收縮活動(dòng)，提示丹皮酚可能抑制了細(xì)胞SOCC的開放而抑制回腸收縮；但是在CIHH大鼠無(wú)此作用，提示CIHH能夠取消丹皮酚的此作用。

NO可激活鳥苷酸環(huán)化酶，從而提高細(xì)胞內(nèi)cGMP水平，降低Ca2+濃度使平滑肌舒張，抑制胃腸運(yùn)動(dòng),也可能通過非cGMP依賴途徑引起平滑肌舒張[8]，L-NAME是NOS的抑制劑，本實(shí)驗(yàn)中L-NAME可部分阻斷丹皮酚對(duì)正常氧和CIHH大鼠回腸收縮活動(dòng)的抑制作用，提示丹皮酚可能通過刺激NOS的活性而增加細(xì)胞內(nèi)NO的含量進(jìn)而抑制回腸收縮。

激動(dòng)β2受體可使回腸平滑肌細(xì)胞舒張[9]，心得安是β受體的阻斷劑。本實(shí)驗(yàn)中心得安部分阻斷了丹皮酚對(duì)正常氧大鼠回腸平滑肌收縮活動(dòng)的抑制作用，提示丹皮酚激動(dòng)了平滑肌的β2受體而抑制回腸收縮；但是CIHH抑制了心得安對(duì)丹皮酚的部分阻斷作用，說(shuō)明CIHH可以通過降低β受體反應(yīng)性，來(lái)對(duì)抗丹皮酚的此項(xiàng)作用，這與以往的報(bào)道相符[2]。

前列腺素（prostaglandin，PG）族的前體花生四烯酸在環(huán)氧合酶（COX）等的作用下可以形成PGE2和PGD2等物質(zhì)，PGE2可以通過作用于EP1受體使腸肌收縮，而PGD2可以通過作用于DP受體使腸肌舒張[10]。吲哚美辛是環(huán)氧合酶的非特異性抑制劑。本實(shí)驗(yàn)中吲哚美辛可部分阻斷丹皮酚對(duì)CON和CIHH大鼠回腸平滑肌的抑制作用，提示丹皮酚可能改變了COX的活性而促進(jìn)了具有舒張作用的PG的合成或釋放進(jìn)而抑制回腸收縮。

CIHH預(yù)處理減弱了丹皮酚對(duì)大鼠離體回腸的抑制作用，其機(jī)制可能是CIHH通過使受體和離子通道敏感性下降實(shí)現(xiàn)的；本研究也發(fā)現(xiàn)CIHH處理后取消了丹皮酚的抑制內(nèi)鈣釋放、抑制庫(kù)容性鈣內(nèi)流和激動(dòng)β2受體作用；至于CIHH處理后為什么改變了離子通道和受體對(duì)丹皮酚的反應(yīng)性及臨床意義有待進(jìn)一步探討。

[1]張翼，楊黃恬，周兆年.間歇性低氧適應(yīng)的心臟保護(hù)[J].生理學(xué)報(bào),2007,59(5):601-613.

[2]王瑩萍，布會(huì)敏，王妹玲，等.慢性間歇性低壓低氧對(duì)家兔竇房結(jié)腎上腺素能受體反應(yīng)性的影響[J].中國(guó)病理生理雜志,2010,26(3)：435-439.

[3]楊正生，彭振輝，姚青海，等.丹皮酚的藥理作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥物與臨床，2011，11(5)：545-547.

[4]謝燕，玄振玉，于莉，等.舒經(jīng)克痛軟膠囊對(duì)大鼠子宮活動(dòng)的影響[J].中國(guó)中藥雜志，2008，33(12)：1466-1469.

[5]劉昌孝，孫瑞元.藥物評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與統(tǒng)計(jì)學(xué)基礎(chǔ)[M].北京：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社,1999：31-32.

[6]宋士軍,李芳芳,徐瑛,等.金銀花和黃芩對(duì)家兔小腸平滑肌收縮和電活動(dòng)的影響[J].中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志,2009,25(3)：344-348.

[7]柯道平,周華,李忠穩(wěn),等.庫(kù)容性Ca2+內(nèi)流介導(dǎo)大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸平滑肌收縮[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2006,22(3)：344-348.

[8]Rosa S,Maria GZ,Flavia M.Nitric oxide induces muscular relax?ation via cyclic GMP-dependent and-independent mechanisms in the longitudinal muscle of the mouse duodenum[J].Nitric Oxide,2003,8(1)：48-52.

[9]白波，高明燦.生理學(xué)[M].第6版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2010：227-228.

[10]徐紅,孫宏斌.前列腺素受體及相關(guān)藥物的研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010,41(5)：385-394.