王振宇，梅 茸，宋京風(fēng)，劉偉平，陸 瑛

(1.昆明醫(yī)學(xué)院云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650500;2.昆明醫(yī)學(xué)院附屬昆華醫(yī)院，云南昆明 650032;3.昆明貴金屬研究所，云南昆明 650221)

自20世紀(jì)60年代新型鉑類(lèi)無(wú)機(jī)抗癌藥物因其獨(dú)特的抗癌機(jī)制及較好的療效，一直是抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)。目前已相繼成功開(kāi)發(fā)了順鉑、卡鉑、奈達(dá)鉑、奧沙利鉑、洛鉑、舒鉑等用于臨床治療癌癥［1］。但該類(lèi)藥物嚴(yán)重的毒性作用一直是限制其臨床應(yīng)用的一大缺陷［2］。舒鉑，化學(xué)名為cis-［(4R，5R)-4，5-雙(氨甲基)-2 異丙基-1，3-二氧環(huán)戊烷］丙二酸根合鉑(Ⅱ)，分子式C11H20N2O6Pt，相對(duì)分子質(zhì)量為471，是由韓國(guó)SK公司開(kāi)發(fā)的第三代鉑類(lèi)抗腫瘤藥物，并于1999年首次在韓國(guó)批準(zhǔn)上市。其對(duì)亞洲國(guó)家發(fā)病率較高的胃癌有顯著療效，同時(shí)也能用于治療結(jié)直腸癌和小細(xì)胞肺癌，甚至對(duì)耐受順鉑、卡鉑的腫瘤有一定療效［3－5］。然而舒鉑在臨床應(yīng)用中仍存在血液、肝、腎及胃腸道等毒性作用［6］，且在理化性質(zhì)上也不太理想。

昆明貴金屬研究所在長(zhǎng)期的研究中發(fā)現(xiàn)，以4，5-雙(氨甲基)-1，3-二氧環(huán)戊烷為載體的鉑配合物有廣闊的抗癌前景，因此合成了數(shù)個(gè)以該基團(tuán)為載體的新化合物，并從中篩選出LLC-0601，化學(xué)名為cis-［(4R，5R)-4，5-雙(氨甲基)-2 異丙基-1，3-二氧環(huán)戊烷］3-羥基-1，1-環(huán)丁烷二羧酸根合鉑(Ⅱ)，分子式C14H24N2O7Pt，相對(duì)分子質(zhì)量526，其理化性質(zhì)和前期體內(nèi)外抗腫瘤活性均優(yōu)于舒鉑。本實(shí)驗(yàn)旨在對(duì)LLC-0601與已上市且結(jié)構(gòu)相似的舒鉑進(jìn)行肝毒性比較研究，為L(zhǎng)LC-0601的臨床研究和開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠，雄性，50只，體質(zhì)量200～250 g。來(lái)源于昆明醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(滇)2005-0008。動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(滇)2005-0009，大鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)屏障環(huán)境，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。

1.2 藥物與試劑

LLC-0601(批號(hào)080620);舒鉑(批號(hào)080321)二者均為白色粉末，由昆明貴金屬研究所提供。順鉑(批號(hào)080401)淡黃色液體，規(guī)格:10 mg，由云南個(gè)舊生物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。5%葡萄糖注射液(批號(hào)C070301b)，規(guī)格:100 ml，由昆明南疆制藥有限公司提供。谷丙轉(zhuǎn)氨酶(glutamic pyruvic transaminase，GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(glutamic oxaloacetic transaminase，GOT)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)由上海榮盛生物科技有限公司生產(chǎn)，總蛋白(total protein，TP)、白蛋白(albumin，ALB)、總膽紅素(total bilirubin，T-Bil)由中生北控生物科技股份有限公司生產(chǎn)。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)和微量丙二醛(malondialdehyde，MDA)由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)。

1.3 儀器

日本產(chǎn)TMS-1024全自動(dòng)生化分析儀;日本產(chǎn)CL-770型臨床分光光度計(jì);國(guó)產(chǎn)ACCULAB ALC-210.3型電子天平;國(guó)產(chǎn)TDZ5-WS平衡離心機(jī);日本產(chǎn)Nikon eclipse 50i生物顯微鏡;北京天地電子科技公司彩色病理顯微鏡圖像分析系統(tǒng)。

1.4 劑量設(shè)計(jì)［7］

前期藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在荷瘤小鼠動(dòng)物模型上，LLC-0601 60 mg·kg－1取得一定的療效，與舒鉑 80 mg·kg－1的療效基本相當(dāng)，LLC-0601 120 mg·kg－1療效則明顯優(yōu)于舒鉑 80 mg·kg－1。因此將這3個(gè)劑量通過(guò)體表面積折算為大鼠劑量，分別為L(zhǎng)LC-0601 34.9 和 69.8 mg·kg－1和舒鉑 46.6 mg·kg－1。因此本實(shí)驗(yàn)設(shè) LLC-0601 40，70 mg·kg－1組和舒鉑40 mg·kg－1組，同時(shí)設(shè)順鉑陽(yáng)性對(duì)照。順鉑常作為動(dòng)物肝腎損傷模型的陽(yáng)性藥物，其小鼠劑量選擇一般為3～4 mg·kg－1，按體表面積折算大鼠為1.75 ～2.33 mg·kg－1，本實(shí)驗(yàn)大鼠順鉑給藥量為2.0 mg·kg－1。

1.5 動(dòng)物分組及給藥

50只大鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為正常對(duì)照(5%葡萄糖)組、順鉑2 mg·kg－1(陽(yáng)性對(duì)照)組、舒鉑40 mg·kg－1組、LLC-0601 40 和 70 mg·kg－1組。大鼠均尾靜脈iv給藥，每天1次，連續(xù)給藥2 d后間隔5 d，再給藥2 d，如此3個(gè)循環(huán)，共注射6次，停藥恢復(fù)觀察28 d。

1.6 血清生化指標(biāo)的檢測(cè)

于末次給藥后24 h和恢復(fù)期結(jié)束分別處死6只和4只動(dòng)物，采血進(jìn)行血清 GPT，GOT，ALP，TP，ALB和T-Bil檢測(cè)。

1.7 肝系數(shù)的計(jì)算和病理組織學(xué)檢查［8］

稱量肝質(zhì)量并計(jì)算肝系數(shù)，以每100 g體質(zhì)量肝所占質(zhì)量表示。肝系數(shù)=肝質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)×100。取部分肝組織進(jìn)行組織勻漿檢測(cè)GSH-Px，TSOD和MDA;取肝組織用4%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，片厚4 μm，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察，進(jìn)行病理組織學(xué)檢查肝炎程度:－為肝基本正常;+為輕度病變，肝細(xì)胞局部點(diǎn)狀壞死，少量炎細(xì)胞浸潤(rùn);++為中度病變，局部肝細(xì)胞灶狀、片狀壞死，多量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物一般情況觀察

LLC-0601 40 mg·kg－1組大鼠未見(jiàn)明顯異常，其余給藥組動(dòng)物均表現(xiàn)出神差、少食、少動(dòng)、豎毛、毛發(fā)無(wú)光澤和體質(zhì)量下降，并隨給藥次數(shù)增加而逐漸加重，舒鉑組最為明顯，給藥結(jié)束前舒鉑組有1只動(dòng)物死亡。

2.2 LLC-0601與舒鉑對(duì)血清生化指標(biāo)的影響

與順鉑組比較，給藥末期舒鉑組血清生化改變最為明顯，GPT明顯升高，TP和ALB明顯降低(P＜0.05，P ＜0.01);而 LLC-0601 40 和 70 mg·kg－1組未見(jiàn)明顯差異。與正常對(duì)照組比，恢復(fù)期順鉑組GPT明顯升高(P＜0.05)。與舒鉑組相比，順鉑組和LLC-0601 40 mg·kg－1組 TP 和 ALB 略低，TP 有顯著性差異(P＜0.05)，但均在正常參考值范圍內(nèi)(表1)。

表1 LLC-0601與舒鉑對(duì)血清生化指標(biāo)的影響Tab.1 Effect of LLC-0601 and heptaplatin on serum biochemical parameters in SD rats

2.3 LLC-0601與舒鉑對(duì)肝質(zhì)量與肝系數(shù)的影響

與正常對(duì)照組相比，給藥末期 LLC-0601 40 mg·kg－1組肝質(zhì)量與肝系數(shù)未見(jiàn)明顯變化，其余給藥組肝質(zhì)量明顯降低(P ＜0.05，P ＜0.01)，以順鉑組和舒鉑組降低最為明顯(P＜0.01);順鉑組肝系數(shù)明顯降低(P ＜0.01);而 LLC-0601 70 mg·kg－1組肝質(zhì)量降低(P＜0.05)，但肝系數(shù)無(wú)顯著性差異?；謴?fù)期各給藥組動(dòng)物肝質(zhì)量與系數(shù)均恢復(fù)正常，組間比較無(wú)顯著性差異(表2)。

2.4 LLC-0601與舒鉑對(duì)肝組織勻漿 GSH-Px，SOD和MDA的影響

與正常對(duì)照組相比，給藥末期各相應(yīng)給藥組GSH-Px無(wú)明顯變化，順鉑組T-SOD有顯著性差異(P＜0.01);而各給藥組 MDA均明顯升高(P＜0.05)。與順鉑組比較，舒鉑和 LLC-0601 40和70 mg·kg－1組 T-SOD 均明顯升高(P ＜0.01)。與正常對(duì)照組和順鉑組比較，恢復(fù)期各給藥組肝GSH-PX，SOD和MDA均無(wú)顯著性差異(表3)。

2.5 LLC-0601與舒鉑對(duì)肝病理組織學(xué)的影響

如圖2和表4所示，正常對(duì)照組和LLC-0601 40 mg·kg－1組動(dòng)物肝給藥末期和恢復(fù)期均未見(jiàn)明顯異常。其余各給藥組均出現(xiàn)不同程度的肝炎性改變，給藥末期順鉑組和LLC-0601 70 mg·kg－1組可見(jiàn)散在的肝細(xì)胞點(diǎn)狀或小灶性壞死，肝竇內(nèi)少量的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，病變較輕微。舒鉑組表現(xiàn)為廣泛的肝細(xì)胞水腫，散在的肝細(xì)胞多灶狀片狀壞死，個(gè)別中央靜脈邊緣和肝竇內(nèi)多量的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)?；謴?fù)期舒鉑組和LLC-0601 70 mg·kg－1組仍可見(jiàn)散在的肝細(xì)胞局部點(diǎn)狀壞死和肝竇內(nèi)少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，病變程度較輕。順鉑組表現(xiàn)為散在或多發(fā)的肝細(xì)胞灶狀片狀壞死，肝竇內(nèi)多量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，病變程度較給藥末期重。

表2 LLC-0601與舒鉑對(duì)肝質(zhì)量與肝系數(shù)的影響Tab.2 Effect of LLC-0601 and heptaplatin on in liver mass and coefficient of rats

表3LLC-0601與舒鉑對(duì)肝組織勻漿谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)，超氧化物歧化酶(SOD)和微量丙二醛(MDA)的影響Tab.3 Effect of LLC-0601 and heptaplatin on glutamic pyruvic transaminase(GSH-Px)，total superoxide dismutase(SOD)and malondialdehyde(MDA)in liver homogenate of rats

圖2 LLC-0601與舒鉑給藥末期對(duì)肝病理組織學(xué)的影響(HE ×100).動(dòng)物處理見(jiàn)表1.A:正常對(duì)照組;B:順鉑組，箭頭示散在的肝細(xì)胞點(diǎn)狀或小灶性壞死;C:舒鉑組，箭頭示肝細(xì)胞散在的多灶性壞死.D:LLC-0601 40 mg·kg－1.E:LLC-0601 70 mg·kg－1，箭頭示散在的肝細(xì)胞點(diǎn)狀或小灶性壞死.Fig.2 Effect of LLC-0601 and hetaplatin representative histopathological changes in the liver of rats(HE ×100).

表4 LLC-0601與舒鉑對(duì)肝病理組織學(xué)的影響Tab.4 Effect of LLC-0601 and heptaplatin on histopathological changes in liver of rats

3 討論

目前上市的幾個(gè)鉑類(lèi)藥物均存在不同程度的肝毒性及其他器官系統(tǒng)毒性，如順鉑的消化系統(tǒng)反應(yīng)、腎毒、神經(jīng)毒、耳毒、肝毒及骨髓抑制等［9］，而舒鉑雖然毒性較順鉑有所降低，但無(wú)論是在臨床前或臨床Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ期研究均發(fā)現(xiàn)了較明顯的不良反應(yīng)［5－6，10－11］。如Ⅰ期的臨床研究中發(fā)現(xiàn)以每天 1 次靜脈滴注1 h，間隔3～4周為一個(gè)循環(huán)，當(dāng)舒鉑劑量達(dá)到480 mg·m－2時(shí)，多數(shù)患者均出現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng)(按 WHO毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)):4級(jí)肝毒性(GPT，GOT升高)、3級(jí)血液毒性(白細(xì)胞、血小板減少和貧血)、2級(jí)腎毒性(氮質(zhì)血癥和蛋白尿，經(jīng)水化治療后測(cè)定)以及2級(jí)消化道反應(yīng)(惡性、嘔吐)等。Ⅱ期的臨床研究中以同樣的給藥方式，舒鉑劑量達(dá)到360～440 mg·m－2時(shí)，同樣觀察到1～2級(jí)的肝毒性、血液毒性、腎毒性和消化道反應(yīng)。此外舒鉑的溶解度小，室溫下溶解度 ＜5 g·L－1。

LLC-0601水溶性好，室溫溶解度可達(dá)到25 g·L－1，水溶液穩(wěn)定性與舒鉑相當(dāng)，避光可穩(wěn)定72 h以上。前期研究結(jié)果顯示其體內(nèi)外對(duì)人的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞和胃癌細(xì)胞均有明顯的抑制作用，而小鼠單次靜脈注射急性毒性實(shí)驗(yàn)LLC-0601的 LD50(372.7 mg·kg－1)約 為 舒 鉑 (196.2 mg·kg－1)的 2 倍。

本研究以順鉑為陽(yáng)性對(duì)照，觀察舒鉑與LLC-0601的肝毒性，從結(jié)果中不難發(fā)現(xiàn)，舒鉑在40 mg·kg－1就出現(xiàn)明顯的肝毒性反應(yīng)，血清GPT升高、TP和ALB降低，提示肝細(xì)胞受損，肝蛋白合成功能降低。同時(shí)肝質(zhì)量和肝系數(shù)均降低，病理組織學(xué)檢查表現(xiàn)為肝細(xì)胞多灶狀壞死和肝竇內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。而LLC-0601 40 mg·kg－1時(shí)幾乎未觀察到任何肝損傷表現(xiàn)，而LLC-0601 70 mg·kg－1時(shí)才出現(xiàn)輕微的肝損傷表現(xiàn)。而順鉑組的肝毒性改變與舒鉑和LLC-0601略有不同，其恢復(fù)期病變程度明顯重于給藥末期，考慮為其在體內(nèi)蓄積而引發(fā)的延遲毒性反應(yīng)。文獻(xiàn)［9，12］報(bào)道，0～5 d順鉑從尿中回收鉑為給藥量的27% ～54%，而0～7 d舒鉑的從尿中回收鉑為給藥量的80%～86%，從其他排泄物中回收鉑為給藥量的8% ～15%，即0～7 d舒鉑總的排除率在90%以上。LLC-0601目前還未進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)研究，尚不能確定其在體內(nèi)的蓄積情況，但根據(jù)其理化性質(zhì)和動(dòng)物恢復(fù)情況，其藥物的排泄率可能與舒鉑相當(dāng)。

順鉑的肝毒性與組織過(guò)氧化損傷相關(guān)［13－14］。順鉑進(jìn)入機(jī)體后可產(chǎn)生大量羥自由基和活性氧自由基，引起膜脂質(zhì)過(guò)氧化，導(dǎo)致膜通透性和膜脂流動(dòng)性的改變，同時(shí)產(chǎn)生多種有毒的降解產(chǎn)物，從而引起組織的氧化損傷。本研究為探索舒鉑和LLC-0601的肝毒性機(jī)制，檢測(cè)了肝組織勻漿中的抗氧化主要指標(biāo)SOD，GSH-Px和MDA。本研究結(jié)果顯示，給藥末期除 LLC-0601 40 mg·kg－1組外，順鉑組、舒鉑組和 LLC-0601 70 mg·kg－1組 SOD 和 GSH-Px均有不同程度的下降，而MDA各給藥組均略高于對(duì)照組，提示氧化損傷是這3種鉑類(lèi)化合物引起肝損傷的原因之一。

綜上所述，在同等劑量下，鉑類(lèi)化合物L(fēng)LC-0601對(duì)SD大鼠的肝毒性明顯小于結(jié)構(gòu)相似的上市藥物舒鉑，是一個(gè)有開(kāi)發(fā)前景的新化合物。

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