張曉利 呂雪蓮 沈永年 呂桂霞 王淼淼 葛一平 劉維達(dá)

(1.暨南大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)博士后流動(dòng)站，廣州510632;2.大連皮膚病醫(yī)院，大連116011;3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所，南京210042;4.蘇州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，蘇州215006)

真菌DNA的提取是包括分子診斷在內(nèi)的所有真菌分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)［1］，簡(jiǎn)便快捷地提取真菌DNA，且獲得的DNA完整、純度高，對(duì)真菌分子生物學(xué)的后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作有極其重要的意義。絲狀真菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)堅(jiān)固，且富含多糖，破壁比較困難，而DNA的提取效率，尤其是DNA的純度可嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果［2］。同一標(biāo)本采用不同方法或不同標(biāo)本采用相同方法提取DNA 其純度和提取率有有很大差異。本實(shí)驗(yàn)以產(chǎn)黑色素最為豐富的黑曲霉為例，通過(guò)檢測(cè)DNA濃度、PCR擴(kuò)增等方法比較了幾種DNA提取方法的優(yōu)劣。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及菌株

引物合成購(gòu)自上海生生物工程技術(shù)設(shè)備有限公司，熱啟動(dòng)Taq酶、dNTP和核酸內(nèi)切酶 Hha I、Hinf I、Hae III、Taq I、Msp I購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。實(shí)驗(yàn)所用標(biāo)準(zhǔn)菌黑曲霉［CMCCC(F).A3］由中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)醫(yī)學(xué)真菌中心提供。

1.2 菌株的培養(yǎng)和收集

將黑曲霉接種到PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7～14 d至成熟，收集上層孢子至生理鹽水中，振蕩，制成孢子懸液，取菌懸液接種至PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)。兩個(gè)時(shí)間段收集菌種:一為3 d菌齡 (菌絲為白色，且該菌株未產(chǎn)生大量黑色的分生孢子);另一為10 d左右菌齡(該菌株產(chǎn)生大量黑色的分生孢子)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)按照石英砂+CTAB法提取基因組DNA。

1.3 DNA 提取方法

包括氯化芐法、石英砂+CTAB法、微波法和Biospin試劑盒法4種方法的比較。

氯化芐法 將菌絲體加入5 mL研磨器中，加500μL的氯化芐提取液，研磨。將研磨液加入1.5 mL無(wú)菌EP管中，再加入125μL 10%SDS和300 μL氯化芐原液。50℃水浴60 min，然后加入NaAc 300μL，冰浴，離心取上清液，加入等體積的異丙醇，室溫沉淀30 min，溶于100μL TE緩沖液。

石英砂+CTAB法 加石英砂及400μL 10×TE Buffer到無(wú)菌的EP管中，刮入菌絲體。加入120 μL 10%SDS，加入10 μL蛋白酶 K，混勻，65℃水浴30 min，加入120μL 5 mol/L NaCl，加入約65 μL的10%CTAB，65℃水浴60 min。加入等體積的氯仿:異戊醇 (24∶1)，輕柔混勻。離心取上清液至無(wú)菌EP管中。加225μL NH4Ac，取上清液至無(wú)菌 EP管中，加入 510μL異丙醇，-20℃放置 30 min，離心棄上清液，用70%乙醇清洗沉淀物，用50 μL TE Buffer溶解沉淀。

微波法 將菌絲體加入5 mL研磨器中，加300μL緩沖液，研磨。將研磨液加入1.5 mL無(wú)菌EP管中，加少量石英砂，加100μL裂解液。將EP管置于微波爐中，600 W，共100 s。加入400μL抽提液，倒置振蕩5 s，加入600μL Tris飽和酚氯仿抽提，混勻5 s。離心取上清液加等體積異丙醇，離心，70%乙醇洗兩次室溫下晾干，用50 μL TE Buffer溶解。

Biospin試劑盒 將菌絲體用5 mL研磨器研磨過(guò)后，放入2 mL微量離心管中。加400μL TE Buffer，于65℃環(huán)境中溫浴30 min。加入130μL DA Buffer，于冰浴中放置5 min。離心將上清液轉(zhuǎn)移離心管，加750μL的E Binding Buffer，將混合液體轉(zhuǎn)移至Spin column，加入500μL的 G Binding Buffer離心，再加入Wash Buffer。最后Spin column中加入150 μL Elution Buffer，離心并棄去 Spin column。

1.4 基因組DNA樣品直接電泳檢測(cè)

取幾種方法提取的基因組DNA 4μL，與適量6×Loading Buffer混合，采用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳緩沖液為1×TAE，恒壓80 V，電泳約30 min。電泳結(jié)束后，取瓊脂糖凝膠在凝膠成像儀上紫外線(xiàn)透射下觀察結(jié)果并攝片。

1.5 基因組DNA-ITS的PCR擴(kuò)增

真菌通用引物 ITS1(5＇-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3＇)和 ITS4(5＇-TCCTCCGCTTATTGATAT-3＇)，反應(yīng)總體積為25 μL，含 4 μL 10 × 緩沖液，1.5 μL MgCl2(10 mmol/L)，2 μL dNTPmix(10 μmol/L)，引物 (10 μmol/L)各 0.5 μL，DNA 模板2μL，Taq DNA聚合酶2U。反應(yīng)條件為95℃ 5 min預(yù)變性后 95℃ 1 min，50℃ 1 min，72℃ 1 min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，每個(gè)加樣孔點(diǎn)樣4 μL，電泳緩沖液為1×TAE，恒壓80 V，電泳約30 min。電泳結(jié)束后，取瓊脂糖凝膠在凝膠成像儀上紫外線(xiàn)透射下觀察結(jié)果并攝片。

1.6 基因組DNA濃度和產(chǎn)率測(cè)定

使用Invitrogen Quant-iTTM試劑盒測(cè)定樣本的濃度，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作;用所測(cè)的DNA濃度和測(cè)量的菌絲體的重量(濕重)之比計(jì)算產(chǎn)率。

2 結(jié) 果

2.1 菌株培養(yǎng)時(shí)間的確定

黑曲霉培養(yǎng)3 d內(nèi)，菌落為白色時(shí)，未長(zhǎng)出黑色孢子，收集的菌落主要為菌絲，用體視顯微鏡觀察結(jié)構(gòu) (見(jiàn)圖1);黑曲霉培養(yǎng)10 d左右，菌落產(chǎn)生大量的孢子和色素，收集的菌落大部分為孢子，并見(jiàn)部分菌絲(見(jiàn)圖2)。培養(yǎng)3 d內(nèi)DNA溶液為透明無(wú)色，培養(yǎng)10 d DNA溶液為淡褐色 (見(jiàn)圖3)。用相應(yīng)的DNA做為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖4。培養(yǎng)3 d內(nèi)DNA模板成功擴(kuò)增出約600 bp的片段，培養(yǎng)10 d的DNA模板PCR反應(yīng)為陰性。

2.2 4種方法提取的黑曲霉基因組DNA直接電泳結(jié)果

4種方法提取的DNA直接電泳都有陽(yáng)性條帶，以石英砂+CTAB法的條帶最亮，且沒(méi)有拖尾;微波法的亮度高，但有明顯拖尾;Biospin試劑盒法的條帶最弱(見(jiàn)圖5)。

2.3 4種方法提取的黑曲霉基因組DNA-ITS的PCR擴(kuò)增結(jié)果

4種方法均能擴(kuò)增出陽(yáng)性條帶，以石英砂+CTAB法條帶最亮 (見(jiàn)圖6)。

2.4 基因組DNA濃度和產(chǎn)率測(cè)定結(jié)果

4種方法中以石英砂+CTAB法提取后的黑曲霉基因組DNA的濃度和產(chǎn)率最高，與基因組DNA直接電泳結(jié)果一致(見(jiàn)表1)。

圖1 培養(yǎng)3 d左右菌落形態(tài) 圖2 培養(yǎng)10 d左右菌落形態(tài) 圖3 基因組DNA溶液 圖4 模板DNA-ITSPCR擴(kuò)增電泳圖 圖5 基因組DNA直接電泳圖:M.100 bp Ladder，1～4.分別為氯化芐法、石英砂+CTAB法、微波法、Biospin試劑盒法 圖6 基因組DNA-ITS的PCR擴(kuò)增結(jié)果:M.100 bp Ladder，1～4.分別為氯化芐法、石英砂+CTAB法、微波法、Biospin試劑盒法Fig.1 Colonies after 3 ds Fig.2 Colonies after 10 ds Fig.3 Template DNA solution Fig.4 Agarose gel electrophoresis of PCR products:M.100 bp Ladder Fig.5 Agarose gel electrophoresis of template DNA:M.100 bp Ladder;1-4.Benzyl Chloride method，quartz sand+CTAB，microwave method，Biospin Fungus Genomic DNA Extraction Kit Fig.6 Agarose gel electrophoresis of PCR products:M.100 bp Ladder;1-4.Benzyl Chloride method，quartz sand+CTAB，microwave method，Biospin Fungus Genomic DNA Extraction Kit

表1 4種方法提取的基因組DNA濃度和產(chǎn)率結(jié)果Tab.1 Concentration and yield results of template DNA by 4 methods

3 討 論

近些年以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)方法不斷發(fā)展并越來(lái)越多地被應(yīng)用至臨床［3］。為保證真菌PCR技術(shù)及其相關(guān)分子生物學(xué)技術(shù)的順利開(kāi)展，簡(jiǎn)單快捷地獲取DNA，且獲得完整、高純度的DNA，是所有病原真菌分子實(shí)驗(yàn)必須解決的前提。DNA的提取效率，尤其是DNA的純度可明顯影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。同一標(biāo)本采用不同方法或不同標(biāo)本采用相同方法提取的DNA其純度和提取率有很大差異。

絲狀真菌細(xì)胞壁堅(jiān)韌厚實(shí)的構(gòu)成需要較為繁瑣的破壁手段，這樣就使真菌DNA的提取較細(xì)菌或其他組織細(xì)胞的難度更大［4］。真菌DNA提取方法頗多，主要區(qū)別在于破壁方法以及破壁后分離核酸、蛋白質(zhì)方法的不同。常用的破壁方法有機(jī)械法、酶法和化學(xué)法等，其中液氮研磨是最常用的機(jī)械破壁方法。但液氮研磨需要的菌體較多，研磨的容器為體積較大的研缽，在研磨過(guò)程中菌體丟失較多，同時(shí)因暴露在空氣中也容易污染;在研磨過(guò)程中如果研磨時(shí)間和力度掌握不好，極易造成基因組DNA的斷裂和不完整［5］。很多學(xué)者在實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，液氮研磨過(guò)的菌體所提取的DNA直接電泳拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重，所以在本實(shí)驗(yàn)中，我們沒(méi)有選擇液氮研磨法作為比對(duì)。

本實(shí)驗(yàn)中，所用的方法能提取到DNA并能成功進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最關(guān)鍵的就是確定了實(shí)驗(yàn)用菌的培養(yǎng)時(shí)間。因?yàn)榻z狀真菌的細(xì)胞壁主要成分為幾丁質(zhì)，與細(xì)菌或者是酵母菌相比其結(jié)構(gòu)要堅(jiān)固。但真菌細(xì)胞壁各成分的比例在細(xì)胞生活周期的過(guò)程中是存在差異的，一般而言，當(dāng)真菌細(xì)胞處于幼嫩時(shí)期時(shí)，破壁相對(duì)容易些［6］。在本實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，我們參考各文獻(xiàn)［7］，用生長(zhǎng)10 d左右的成熟菌株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，但所得DNA溶液均有不同程度的黑色素溶解其中。雖然后來(lái)也制訂了相應(yīng)的純化方法，使之能夠成功進(jìn)行PCR擴(kuò)增，但純化過(guò)程包括離心，清洗等步驟，耗時(shí)在1～2 h之間;有時(shí)候一次純化不成功，尚需要第二次、第三次純化，DNA的含量會(huì)隨之逐次明顯減少。所以我們選擇了生長(zhǎng)伊始的菌落，大部分為菌絲，只有少量孢子，不僅破壁較容易，DNA獲取率高，最終提取的DNA較純，沒(méi)有抑制PCR反應(yīng)的色素存在，可以不用純化直接用于PCR擴(kuò)增。更重要的，我們認(rèn)為，在菌落早期提取DNA不僅可以提前數(shù)天 (5 d以上)進(jìn)行菌種鑒定，也意味著可以提前對(duì)接種了一定量標(biāo)本的培養(yǎng)基上剛長(zhǎng)出的菌落進(jìn)行基因型鑒定，即可以大大縮短鑒定絲狀真菌所需的時(shí)間，這對(duì)臨床遇到的由絲狀真菌引起的危重感染的救治十分重要和關(guān)鍵。

4種提取方法均能獲得一定量的DNA，長(zhǎng)度一致，但提取率和純度因方法的不同有較大差異。石英砂+CTAB法所得的基因組DNA濃度最大，明顯要高于其他三種方法，后續(xù)的PCR反應(yīng)得到的條帶也最亮;微波法雖然得到的基因組DNA濃度較好，但純度較差，有明顯的拖尾;Biospin試劑盒提取基因組DNA量較少，但純度高，并且整個(gè)實(shí)驗(yàn)所耗時(shí)間較短，不需要另外配制試劑和高溫高壓滅菌，在實(shí)驗(yàn)較急且沒(méi)有相應(yīng)試劑的情況下可以試用。

［1］ Chen SC，Halliday CL，Meyer W.A review of nucleic acidbased diagnostic tests for systemic mycoses with an emphasis on polymerase chain reaction-based assays［J］.Med Mycol，2002，40(4):333-357.

［2］ Maaroufi Y，Ahariz N，Husson M，et al.Comparison of different methods of isolation of DNA of commonly encountered Candida species and its quantitation by using a real-time PCR-based assay［J］.J Clin Microbiol，2004，42(7):3159-3163.

［3］ 張曉利，呂雪蓮，沈永年，等.PCR-RFLP和多重PCR技術(shù)檢測(cè)常見(jiàn)病原性絲狀真菌的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)真菌學(xué)雜志，2010，4(5):105-108.

［4］ Haugland RA，Brinkman N，Vesper SJ.Evaluation of rapid DNA extraction methods for the quantitative detection of fungi using realtime PCR analysis［J］.JMicrobiol Methods，2002，50(3):319-323.

［5］ Haugland RA，Heckman JL，Wymer LJ.Evaluation of different methods for the extraction of DNA from fungal conidia by quantitative competitive PCR analysis［J］.JMicrobiol Methods，1999，37(2):165-176.

［6］ Griffin DW，Kellogg CA，Peak KK，et al.A rapid and efficient assay for extracting DNA from fungi［J］.Lett Appl Microbiol，2002，34(3):210-214.

［7］ Clarkson AI，Lefevre P，Titchener-Hooker NJ.A study of process interactions between cell disruption and debris clarification stages in the recovery of yeast intracellular products［J］.Biotechnol Prog，1993，9(5):462-467.