劉長(zhǎng)山 王秀軍 柳 林 孫麗萍 劉海霞 明 義 (濰坊市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，山東 濰坊 261041)

高血糖導(dǎo)致的蛋白質(zhì)非酶糖化是糖尿病腎病(DN)的重要發(fā)病機(jī)制〔1〕。有研究證明細(xì)胞凋亡參與了DN發(fā)生的整個(gè)過程。但非酶糖化與細(xì)胞凋亡的關(guān)系研究資料不多。本研究制備糖尿病大鼠動(dòng)物模型，測(cè)定組織非酶糖化，觀察腎臟細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，并予以非酶糖化抑制劑氨基胍進(jìn)行干預(yù)治療，以研究非酶糖化與細(xì)胞凋亡的關(guān)系，探討抑制非酶糖化、防止細(xì)胞凋亡進(jìn)而防治DN可能性。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、主要藥品、試劑及儀器 清潔級(jí)雄性Wistar大鼠，體重180～200 g，6周齡，健康，由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證SCXK(魯)20030004。鏈脲佐菌素(STZ):美國(guó)Alexi公司。氨基胍:美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。Bcl-2、Bax免疫組化測(cè)定藥盒:北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。尿白蛋白測(cè)定試劑盒:天津DPC公司。One Touch血糖儀:美國(guó)強(qiáng)生公司。H-7500透射電鏡，850型熒光分光光度計(jì):日本HITACHI公司。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病大鼠動(dòng)物模型的建立 Wistar雄性大鼠30只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，隨機(jī)取10只為正常對(duì)照組喂養(yǎng)常規(guī)飼料。其余20只擬作為DN組，左下腹腔按60 mg/kg體重單次注射STZ溶液，注射后72 h斷尾取血測(cè)血糖(One Touch血糖儀)，血糖≥16.7 mmol/L為DN模型建立，并納入本實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及藥物干預(yù)過程 將20只模型大鼠隨機(jī)分為2組進(jìn)行試驗(yàn)，DN組，氨基胍治療組;每組10只，各組間血糖值相差不大于1 mmol/L。大鼠在造模成功后即開始給藥，每日灌胃給藥1次，氨基胍組100 mg·kg-1·d-1，糖尿病對(duì)照組和正常對(duì)照組應(yīng)用等容量生理鹽水1 ml/100 g/d。灌胃開始后第4，8，12，16 w分別測(cè)定血糖和留取24 h尿液測(cè)定尿白蛋白定量，并記錄結(jié)果。實(shí)驗(yàn)過程中，大鼠死亡1只，共29只大鼠完成全部實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.3 動(dòng)物處死與標(biāo)本制備 16 w時(shí)，用10%水合氯醛按400 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠處死大鼠。取右腎組織放于4%中性甲醛中固定，備進(jìn)行免疫組化染色。取左腎少量皮質(zhì)，備進(jìn)行電鏡觀察。取左腎剩余皮質(zhì)稱重，置于-70℃冰箱保存，備進(jìn)行非酶糖化測(cè)定。

1.2.4 腎皮質(zhì)晚期糖化終產(chǎn)物(AGEs)測(cè)定 參照Nakayama等〔2〕和 Brownless等〔3〕方法進(jìn)行羥脯氨酸含量測(cè)定，將測(cè)得的羥脯氨酸值乘以因子7.14，即為膠原含量。最后腎皮質(zhì)中AGEs含量以每mg膠原中相對(duì)熒光強(qiáng)度(AUF/mg)表示。

1.2.5 Bcl-2、Bax蛋白免疫組織化學(xué)染色 常規(guī)石蠟切片，透明、復(fù)水，按1∶100比例稀釋的小鼠抗大鼠Bax和Bcl-2抗體，滴加生物素化羊抗小鼠IgG二抗工作液，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的卵白素工作液，DAB顯色。

1.2.6 腎組織透射電子顯微鏡超微結(jié)構(gòu)觀察 將腎組織切成1 mm3左右的小塊，用3%戊二醛固定，1%鋨酸后固定，Epon812包埋。用透射電鏡下觀察并拍照。每只動(dòng)物的腎組織隨機(jī)選12處腎小球基底膜和12處系膜區(qū)拍照，然后用圖像分析處理儀計(jì)算出每個(gè)腎組織的平均腎小球基底膜厚度和平均系膜間隙面積。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以±s表示，各組數(shù)據(jù)間的比較采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)前后大鼠體重與血糖水平 藥物干預(yù)前DN大鼠體重與正常對(duì)照組均無明顯差異(P＞0.05)，血糖均顯著高于正常對(duì)照組(P＜0.01);治療16 w結(jié)束時(shí)，DN大鼠體重明顯低于正常對(duì)照組，氨基胍治療組血糖與治療前比較無顯著差異(P＞0.05)，DN兩組間體重?zé)o明顯差異(P＞0.05)。見表1。

2.2 氨基胍對(duì)DN大鼠腎組織非酶糖化的影響 治療結(jié)束時(shí)，DN組AGEs含量明顯高于正常對(duì)照〔(251.09±51.74)，(118.34±21.51)AUF/mg，P ＜0.01〕，氨基胍治療組 AGEs含量明顯低于DN組〔(139.18±36.4)AUF/mg，P＜0.01〕。

2.3 實(shí)驗(yàn)后各組DN大鼠尿白蛋白定量變化 隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的進(jìn)展，糖尿病組大鼠尿白蛋白有上升趨勢(shì)，用氨基胍治療后尿白蛋白基本維持不變，治療16 w末，氨基胍組尿白蛋白水平與4 w末相當(dāng)，但糖尿病對(duì)照組尿白蛋白定量顯著升高。見表2。

2.4 腎臟透射電子顯微鏡觀察加細(xì)胞計(jì)量 DN組大鼠腎小球基底膜厚度明顯高于正常對(duì)照組，用氨基胍治療后，治療組GBM厚度明顯低于DN組但仍厚于正常組。腎小球系膜間隙面積DN組明顯高于正常對(duì)照組。應(yīng)用氨基胍治療后，系膜間隙顯著低于DN組，與正常對(duì)照組差異無顯著性。見表3。

表1 各組大鼠體重和血糖比較(±s)

表1 各組大鼠體重和血糖比較(±s)

組別 n 體重(g)實(shí)驗(yàn)前 實(shí)驗(yàn)16 w后血糖(mmol/L)實(shí)驗(yàn)前 實(shí)驗(yàn)16 w后正常對(duì)照組 10 272.2±12.3 505.4±55.6 7.13±1.02 7.52±0.90 DN組 9 272.8±14.5 315.5±24.3 21.39±4.28 21.86±4.41氨基胍治療組 10 271.8±10.2 298.2±26.9 20.89±4.60 22.41±4.19

表2 大鼠4～16 w尿白蛋白含量變化(x ± s，mg/L)

表3 腎小球基底膜厚度和系膜間隙面積(±s)

表3 腎小球基底膜厚度和系膜間隙面積(±s)

與正常對(duì)照組比較:1)P＜0.05;與DN組比較:2)P＜0.05

組別 n 腎小球基底膜厚度(nm) 系膜間隙面積(μm2)10 193.0±6.87 10.66±2.36 DN組 9 221.2±7.291) 16.66±3.401)氨基胍治療組 10 222.6±6.212) 12.71±2.582)正常對(duì)照組

2.5 凋亡相關(guān)蛋白免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

2.5.1 Bcl-2蛋白表達(dá)結(jié)果 Bcl-2蛋白主要位于腎小管，在細(xì)胞漿和細(xì)胞膜表達(dá)。正常對(duì)照組大鼠腎臟Bcl-2蛋白明顯表達(dá)，DN組腎小管Bcl-2蛋白表達(dá)減少，而氨基胍治療組Bcl-2蛋白表達(dá)較DN組增多。

2.5.2 Bax蛋白表達(dá)結(jié)果 Bax蛋白在腎小球、腎小管均有表達(dá)，表達(dá)在胞漿內(nèi)。正常對(duì)照組表達(dá)較弱，DN組蛋白表達(dá)明顯增多，而氨基胍治療組Bax蛋白表達(dá)較DN組有所減少。

2.6 透射電子顯微鏡細(xì)胞凋亡觀察 電鏡下可見正常大鼠腎小管上皮細(xì)胞有微絨毛，細(xì)胞膜完整，細(xì)胞器豐富，基底膜質(zhì)膜內(nèi)褶，線粒體良好，無線粒體腫脹。DN組大鼠腎組織系膜細(xì)胞局部、核內(nèi)染色質(zhì)趨邊濃縮、聚集、細(xì)胞核周間隙增寬，細(xì)胞線粒體明顯腫脹，細(xì)胞質(zhì)吞飲泡大量增多，有的線粒體出現(xiàn)空泡樣改變，上皮細(xì)胞內(nèi)可見凋亡小體。腎小管上皮細(xì)胞有細(xì)胞核固縮，核染色質(zhì)邊集。DN大鼠腎組織基膜內(nèi)有系膜基質(zhì)插入，治療組大鼠腎組織細(xì)胞核固縮、染色質(zhì)趨邊減輕，線粒體腫脹不明顯。

3 討論

DN的發(fā)生發(fā)展與血糖升高程度、持續(xù)時(shí)間密切相關(guān)，高血糖導(dǎo)致的蛋白質(zhì)非酶糖化是DN的關(guān)鍵啟動(dòng)因素，蛋白質(zhì)的非酶糖化是指葡萄糖分子通過親核添加作用而不須酶的催化即與蛋白質(zhì)的氨基相結(jié)合，葡萄糖分子中的羰基先與ε氨基結(jié)合形成醛亞胺(aldimine)，即Schiff堿，這是一個(gè)不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物，Schiff堿進(jìn)一步經(jīng)過分子重排變成比較穩(wěn)定的酮胺化合物，稱為Amadori產(chǎn)物，Amadori產(chǎn)物比較穩(wěn)定，反應(yīng)的可逆性大大降低，Amadori產(chǎn)物大部分經(jīng)過脫水和分子重排，形成復(fù)雜的、生理轉(zhuǎn)化率很低的大分子AGEs〔4〕，AGEs的形成引起腎小球毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)和功能的改變，導(dǎo)致DN發(fā)生發(fā)展。

近年來大量研究顯示，細(xì)胞凋亡在DN的發(fā)生與發(fā)展中起著重要作用，DN高血糖狀態(tài)下的代謝紊亂使細(xì)胞凋亡增加是發(fā)生DN的重要原因，多種病理類型腎病的發(fā)生發(fā)展及損傷后的修復(fù)過程均伴隨著細(xì)胞凋亡參與〔5〕。

凋亡相關(guān)基因可分為凋亡促進(jìn)基因和抑制基因兩種。這兩類基因相互作用的結(jié)果決定細(xì)胞是生存還是凋亡。抑制基因中最具代表性的是Bcl-2，它可以阻止細(xì)胞凋亡〔6〕。Bcl-2基因的同源基因之一是Bax基因，它的過度表達(dá)可拮抗Bcl-2的保護(hù)效應(yīng)而使細(xì)胞趨于凋亡。

蛋白質(zhì)非酶糖化與細(xì)胞凋亡之間存在復(fù)雜的病理生理聯(lián)系，Zoubin等發(fā)現(xiàn)AGEs可以通過多種途徑導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，①通過調(diào)節(jié)促凋亡基因Bax Blf-1 Nip-3和抗凋亡基因Bcl-2 Mcl-1的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。②通過細(xì)胞質(zhì)和線粒體途徑激活細(xì)胞凋亡相關(guān)酶(caspase-3，8，9)促使細(xì)胞凋亡〔7〕。

本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，糖尿病時(shí)高血糖通過可能通過增加腎臟非酶糖化而調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因Bcl-2和Bax的表達(dá)，誘導(dǎo)腎小管、腎小球細(xì)胞凋亡而參與DN的發(fā)生發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為氨基胍對(duì)DN的病理?yè)p害有明顯的保護(hù)作用，因而使用非酶糖化抑制劑防治DN可能起到一定的效果。

氨基胍是一種親質(zhì)子肼類化合物，氨基胍比蛋白質(zhì)中賴氨酸ε-氨基更活躍，通過與早期糖基化蛋白質(zhì)Amadori產(chǎn)物或其衍生物如3-脫氧葡萄糖酮醛作用，使Amadori產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為替代性Amadori產(chǎn)物，阻止它進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)锳GEs。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已表明，氨基胍可明顯抑制AGEs的形成以及長(zhǎng)期改善高血糖狀態(tài)下AGEs在血管壁上的積聚，發(fā)揮其對(duì)DN的防治作用。但其毒副作用較大，限制了臨床應(yīng)用。DN病程遷延，這就決定其用藥治療的過程將是長(zhǎng)期的甚至是終生的，藥物的副作用及費(fèi)用均應(yīng)考慮。尋找毒副作用小、價(jià)格低的非酶糖化抑制劑用于防治DN將是今后努力的方向。

1 DCCT:The Diabetes Control and Complications Trial Research Group.The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitus〔J〕.N Engl J Med，1993;329(14):977-86.

2 Nakayama H，Mitsuhashi T，Kuwajima S，et al.Immunochemical detection of advanced glyclation end products in lens crystallins from streptozocininduced diabetic rat〔J〕.Diabetes，1993;42(2):345-50.

3 Brownlee M，Vlassara H，Kooney A，et al.Aminoguani N dine prevents diabetes-induced arterial wall protein cross-linking〔J〕.Science，1986;232(4757):1629-32.

4 Gohda T，Tanimoto M，Moon JY.Increased serum endogenous secretory receptor for advanced glycation end-product(esRAGE)levels in type 2 diabetic patients with decreased renal function〔J〕.Diabetes Res Clin Pract，2008;81(2):196-201.

5 Sano K，F(xiàn)ujigaki Y，Miyaji T，et al.Role of apoptosis in uranyl acetateinduced acute renal failure and acquired resistance to uranyl acetate〔J〕.Kidney Int，2000;57(4):1560-70.

6 Tsujimoto Y，Croce CM.Analysis of the structure，transcripts，and protein products of bcl-2，the gene involved in human follicular lymphoma〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1986;83(14):5214-8.

7 Alikhani Z，Alikhani M，Boyd CM，et al.Advanced glycation end products enhance expression of pro-apoptolic genes and stimulate fibroblast apoptosis through cytoplasmic and mitochondrial pathway〔J〕.J Bio Chem，2005;280(13):12087-95.