潘奇正 張 蕾 吳金義 (吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 3002)

冠心病是由于冠狀動(dòng)脈粥樣硬化或血管痙攣使管腔狹窄或阻塞而導(dǎo)致心肌缺血、缺氧，引起的心肌損傷或壞死。大量證據(jù)表明，在缺血早期出現(xiàn)心肌細(xì)胞死亡主要由細(xì)胞凋亡介導(dǎo)的，而非細(xì)胞壞死〔1〕。但心肌缺血性損傷的病因和發(fā)病機(jī)制目前并不完全清楚。目前認(rèn)為，氧自由基和炎性細(xì)胞因子介導(dǎo)的損傷在心肌缺血過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本文就線粒體氧化應(yīng)激對(duì)心肌缺血性損傷的作用機(jī)制進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠16只，雄性，體重180～200 g，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物部飼養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑和儀器 鹽酸異丙腎上腺素(ISO，上海禾豐制藥廠)，乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒，肌酸激酶(CK)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，GF-D 200型半自動(dòng)生化分析儀(山東高密彩虹分析儀器公司)。8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷(8-OhDG)購(gòu)自日本JAICA公司;半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及心肌缺血缺氧損傷模型制作 將大鼠隨機(jī)分為兩組，每組8只。對(duì)照組腹腔注射等量生理鹽水;實(shí)驗(yàn)組給予ISO 5 mg/kg腹腔注射，每隔24 h重復(fù)注射1次，連續(xù)注射3 d。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組于第3次注射后24 h處死。

1.2.2 大鼠血清樣本的制備 分別于處死大鼠前穿刺尾靜脈或斷尾獲取外周血1 ml，3 000 r/min(r=6 cm)，離心5 min，取上清，再于高速低溫離心機(jī)13 000 r/min(r=6 cm)，離心15 min，取上清，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 心臟病理組織學(xué)檢測(cè)標(biāo)本的制備 第3次注射后24 h處死對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠，消毒后取出心臟，放入磷酸鹽緩沖液(PBS)中沖洗，10%甲醛溶液固定;經(jīng)常規(guī)石蠟包埋后做4μm連續(xù)切片，進(jìn)行HE和免疫組織化學(xué)染色(SP法)。

1.2.4 結(jié)果判定 以心肌細(xì)胞質(zhì)、胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒，著色強(qiáng)度高于背景染色者判定為陽(yáng)性，無(wú)則為陰性。由兩名觀察者獨(dú)立完成判斷，二者若存在矛盾，則兩者在顯微鏡下共同觀察解決。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，各組數(shù)據(jù)采用±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血清心肌酶學(xué)檢測(cè) LDH檢測(cè)結(jié)果顯示，ISO處理組血清LDH活性升高，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.01);CK檢測(cè)結(jié)果顯示，ISO處理組血清CK活性升高，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.01)。見(jiàn)表1。

表1 各組血清CK和LDH活性比較(±s)

表1 各組血清CK和LDH活性比較(±s)

與對(duì)照組比較:1)P＜0.01

組別 n CK(U/ml) LDH(U/L)對(duì)照組8 43.69±4.82 4 317.60±690.82 ISO組 8 58.32±5.761) 6 762.70±786.761)

2.2 各組大鼠心肌缺血缺氧損傷的病理組織學(xué)觀察 HE染色顯示對(duì)照組心肌橫紋清晰，核居中，未見(jiàn)組織壞死、血管擴(kuò)張及炎細(xì)胞滲出與浸潤(rùn)。實(shí)驗(yàn)組心內(nèi)膜內(nèi)皮不完整，在心肌細(xì)胞間可見(jiàn)小血管的擴(kuò)張及少量紅細(xì)胞滲出，部分心肌細(xì)胞腫脹、變性壞死，心肌組織內(nèi)可見(jiàn)血管擴(kuò)張、炎細(xì)胞滲出、浸潤(rùn)及其包繞血管形成的血管周圍炎。見(jiàn)圖1。

圖1 各組心肌H＆E染色(×400)

圖2 各組8-OhDG免疫組織化學(xué)染色(×400)

2.3 8-OhDG免疫組化染色結(jié)果 如圖2所示，對(duì)照組注射生理鹽水后3 d大鼠心肌中無(wú)陽(yáng)性物質(zhì);注射ISO后3 d后心肌細(xì)胞胞漿8-OhDG表達(dá)明顯高于對(duì)照組。

2.4 Caspase-3免疫組化染色結(jié)果 對(duì)照組注射生理鹽水后3 d大鼠心肌中無(wú)陽(yáng)性物質(zhì);注射ISO后3 d后心肌Caspase-3表達(dá)明顯高于對(duì)照組。見(jiàn)圖3。

圖3 各組Caspase-3免疫組織化學(xué)染色(×400)

3 討論

大劑量ISO導(dǎo)致心臟β1受體過(guò)度興奮，心率加快，心肌收縮力增加，心肌耗氧增加;β2受體興奮，擴(kuò)張外周血管，降低外周血管阻力，血壓降低，特別是舒張壓降低，減少冠狀動(dòng)脈供血，結(jié)果使心肌缺血缺氧〔2〕。缺血性心肌酶的釋放量是心肌損害程度的主要標(biāo)志，本研究發(fā)現(xiàn)，間隔24 h，連續(xù)3次，腹腔注射給予ISO后血清CK、LDH活性增高，表明此方法能夠完全模擬心肌損傷的病理生理過(guò)程，復(fù)制心肌損傷的模型。心肌病理學(xué)檢查更是心肌缺血損害程度的直接證據(jù)。心肌代謝，特別是氧的供需矛盾，是冠心病的重要病理生理變化。心肌缺血可導(dǎo)致心肌內(nèi)出現(xiàn)大量的氧自由基，過(guò)量的氧自由基損傷細(xì)胞的蛋白，脂質(zhì)和DNA，并誘發(fā)炎癥反應(yīng)〔3～5〕。而線粒體DNA由于缺乏組蛋白的保護(hù)，更易受到氧化應(yīng)激損傷〔6〕。本實(shí)驗(yàn)使用DNA 氧化應(yīng)激損傷特異性標(biāo)記 8-OhDG〔7，8〕，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，8-OhDG陽(yáng)性表達(dá)于胞漿，說(shuō)明線粒體DNA受到損傷，而非細(xì)胞核DNA損傷。HE染色顯示心肌細(xì)胞發(fā)生變性壞死，伴有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn);免疫組織化學(xué)染色見(jiàn)部分心肌細(xì)胞表達(dá)Caspase-3。這些結(jié)果表明，心肌缺血導(dǎo)致大量氧自由基的釋放，使線粒體DNA損傷，影響線粒體呼吸鏈功能，導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝障礙，激活Caspase-3細(xì)胞凋亡途徑，引起心肌細(xì)胞發(fā)生不可逆性損傷甚至壞死。因此，采用ISO誘導(dǎo)的大鼠心肌損傷模型，能夠模擬缺血性心臟病的發(fā)病。其機(jī)制在于氧化應(yīng)激導(dǎo)致的心肌細(xì)胞線粒體DNA損傷，并通過(guò)Caspase-3路徑誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。本研究對(duì)于心肌缺血缺氧的發(fā)病機(jī)制提供了新視點(diǎn)，以保護(hù)線粒體為切入點(diǎn)，為臨床對(duì)癥治療提供了新思路。

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