趙 欣 吳 杰 李愛(ài)麗 (吉林大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春 130041)

表皮生長(zhǎng)因子 (EGF)是一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有一定營(yíng)養(yǎng)、保護(hù)作用。然而，在腦缺血再灌注損傷過(guò)程中，EGF對(duì)小腦的動(dòng)態(tài)保護(hù)作用如何，目前國(guó)內(nèi)、外尚無(wú)此類報(bào)道。本研究選用老齡大鼠制作全腦缺血再灌注模型，應(yīng)用免疫組化技術(shù)研究全腦缺血再灌注大鼠小腦 EGF的含量變化，探討腦缺血再灌注損傷過(guò)程中EGF對(duì)小腦的動(dòng)態(tài)保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用Wistar老齡大鼠30只，雌性16只，雄性14只，體重420～520 g，月齡10個(gè)月以上。雌雄分開(kāi)飼養(yǎng)并隨機(jī)分組，假手術(shù)組5只;腦缺血15 min再灌注1 h和6 h、2 d、4 d、9 d 5 組，每組5只。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 采用改良Pulsinelli-Brierley血管阻塞法，用10%水合氯醛給大鼠進(jìn)行腹腔麻醉(0.3 ml/100 g)，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，用兩根縫合線分別繞過(guò)兩側(cè)頸總動(dòng)脈系一松套(待次日拉套斷流用)，電凝雙側(cè)椎動(dòng)脈24 h后在大鼠清醒狀態(tài)下拉雙側(cè)頸總動(dòng)脈套，阻斷雙側(cè)頸總動(dòng)脈血流15 min，此為腦缺血期，去除頸總動(dòng)脈套為再灌注期。假手術(shù)組不做椎動(dòng)脈電凝、頸總動(dòng)脈斷流，其余過(guò)程同實(shí)驗(yàn)組。

1.2.2 試劑與儀器 各組大鼠在完成實(shí)驗(yàn)過(guò)程后給予10%水合氯醛過(guò)量腹腔麻醉，暴露心臟，剪開(kāi)右心耳，在左心室插管，先用200 ml生理鹽水灌沖，然后用4%多聚甲醛固定腦組織，取腦分離出小腦，浸腦組織于相同固定液中48 h，石蠟包埋，免疫組化染色采用ABC法。試劑盒由北京中山生物技術(shù)有限公司提供。

1.2.3 測(cè)定指標(biāo) 神經(jīng)元、間質(zhì)細(xì)胞中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒判斷為陽(yáng)性細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS10.0軟件，計(jì)量資料以±s組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

在對(duì)照組，小腦分子層、梨狀細(xì)胞層、顆粒細(xì)胞層和髓質(zhì)均可見(jiàn)少量EGF免疫陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，棕褐色顆粒存在于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中。

在小腦分子層，缺血再灌注1～6 h時(shí)EGF表達(dá)與對(duì)照組沒(méi)有明顯差異(P＞0.05);再灌注2 d，其表達(dá)明顯增加(P＜0.05)，但再灌注4～9 d時(shí)EGF表達(dá)恢復(fù)至對(duì)照組水平(P＞0.05)。在小腦梨狀細(xì)胞層，缺血再灌注1～6 h時(shí)EGF表達(dá)與對(duì)照組無(wú)明顯差異(P＞0.05);再灌注2 d，EGF表達(dá)呈一過(guò)性增高(P＜0.05)，此后降至正常水平。在小腦顆粒細(xì)胞層，于缺血再灌注1～6 h時(shí)EGF表達(dá)與對(duì)照組沒(méi)有明顯差異(P＞0.05);再灌注2～4 d，其表達(dá)持續(xù)增加。隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，9 d時(shí)，EGF表達(dá)恢復(fù)至對(duì)照組水平(P＞0.05)。在小腦髓質(zhì)，缺血再灌注1 h時(shí)EGF表達(dá)與對(duì)照組沒(méi)有明顯差異(P＞0.05);再灌注6 h～9 d，其表達(dá)持續(xù)減少，低于對(duì)照組水平(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 大鼠缺血再灌注不同時(shí)間小腦EGF的表達(dá)(±s)

表1 大鼠缺血再灌注不同時(shí)間小腦EGF的表達(dá)(±s)

與假手術(shù)組比較:1)P＜0.05;不同時(shí)間點(diǎn)各實(shí)驗(yàn)組比較:2)P＜0.05

7.02±2.10 6.30±2.02 5.21±0.63 10.67±1.15再灌注1 h 5 7.05±1.36 8.32±0.81 6.02±0.62 9.36±2.01再灌注6 h 5 8.49±1.69 8.96±1.18 7.35±1.12 6.37±1.381)再灌注2 d 5 13.66±1.81)2) 10.90±1.221) 9.09±1.061) 6.55±1.521)再灌注4 d 5 9.30±1.982) 7.63±1.012) 9.98±1.581) 6.33±1.631)再灌注9 d 5 6.30±0.982) 6.80±1.35 6.66±1.192) 5.36±1.181)分子層 梨狀細(xì)胞層 顆粒細(xì)胞層 髓質(zhì)對(duì)照組組別 n 5

3 討論

3.1 EGF的生物學(xué)特性及其作用機(jī)制 EGF是1962年由Cohen從雄鼠頜下腺中分離提取的一種可刺激神經(jīng)生長(zhǎng)的活性物質(zhì)，主要由頜下腺腺管細(xì)胞分泌。EGF也見(jiàn)于生理狀態(tài)下的幾乎所有體液中，如唾液、血液、尿液、胃液、羊水、組織液等。盡管外周血EGF含量極少，但血小板顆粒內(nèi)的EGF濃度卻很高。成熟的EGF是具有53個(gè)氨基酸殘基的單鏈多肽，分子量6 045 Da。EGF受體廣泛分布于哺乳動(dòng)物的上皮細(xì)胞，EGF與靶細(xì)胞表面的受體結(jié)合，通常具有高親和性、可飽和性、特異性等特征。EGF的生物學(xué)活性可分兩類:①遲發(fā)效應(yīng):促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的DNA合成，激活鳥(niǎo)氨酸脫羧酶，引起腐胺的積累，提高γ-谷氨酸轉(zhuǎn)肽酶的基礎(chǔ)水平，增加角蛋白、纖維蛋白和膠原蛋白的合成，促進(jìn)骨形成等。②短期效應(yīng):發(fā)生在攝入EGF的數(shù)秒鐘到數(shù)分鐘內(nèi)，包括促進(jìn)或抑制離子、分子的轉(zhuǎn)運(yùn)，影響磷酸鹽的代謝等。EGF與其受體結(jié)合后能促進(jìn)創(chuàng)傷愈合，已被用于角膜、胃、腸道、肝臟、骨骼、神經(jīng)等多種組織創(chuàng)傷的研究。EGF對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)均有重要作用，其作用機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。有學(xué)者認(rèn)為可能與一種神經(jīng)介質(zhì)合成酶的酪氨酸羥化酶的水平變化有關(guān)。生理狀態(tài)下，1 ng/ml的EGF就能顯著提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的存活力和軸索的再生能力，當(dāng)EGF達(dá)到10 ng/ml時(shí)作用達(dá)到頂點(diǎn)。EGF對(duì)帕金森病患者黑質(zhì)紋狀體多巴胺神經(jīng)元具有保護(hù)作用〔1〕，對(duì)外周神經(jīng)也具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用，因?yàn)樽钄郋GF的信息傳遞途徑能明顯影響神經(jīng)軸突的生長(zhǎng)〔2〕。

3.2 EGF的表達(dá)及意義 本研究結(jié)果顯示，小腦缺血再灌注1 h其各層結(jié)構(gòu)EGF的表達(dá)均無(wú)明顯增加;于缺血再灌注6 h小腦分子層、顆粒細(xì)胞層和梨狀細(xì)胞層其表達(dá)也無(wú)明顯增加，這表明小腦分子層、顆粒細(xì)胞層和梨狀細(xì)胞層均不具有快速敏捷的EGF保護(hù)作用，這就提示臨床醫(yī)生在缺血性腦血管疾病早期應(yīng)盡早給予神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)劑治療，以保護(hù)受損的腦組織。再灌注2 d，除小腦髓質(zhì)外其他三層結(jié)構(gòu)EGF表達(dá)均增加，說(shuō)明小腦大部分組織具有遲發(fā)性EGF的保護(hù)作用。筆者以往關(guān)于海馬與EGF的研究中，缺血再灌注6 h海馬內(nèi)EGF表達(dá)即開(kāi)始增加，故小腦與海馬相比前者EGF的保護(hù)作用具有滯后性。再灌注4～9 d，小腦分子層和梨狀細(xì)胞層EGF表達(dá)均回降至基礎(chǔ)水平，表明小腦分子層和梨狀細(xì)胞層EGF的保護(hù)作用較為短暫。而小腦顆粒細(xì)胞層于再灌注4 d EGF表達(dá)仍在增加，再灌注9 d時(shí)EGF表達(dá)降至對(duì)照組水平，說(shuō)明小腦顆粒細(xì)胞層EGF的神經(jīng)元保護(hù)作用強(qiáng)于小腦其他各層，故小腦顆粒細(xì)胞層具有較為持久的EGF保護(hù)作用。EGF是通過(guò)一氧化氮酶抑制細(xì)胞凋亡而對(duì)小腦顆粒細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用〔3〕。小腦髓質(zhì)于再灌注6 h～9 d期間，EGF的表達(dá)一直處在低于假手術(shù)組水平，這表明小腦髓質(zhì)缺乏EGF的保護(hù)作用，提示臨床小腦髓質(zhì)可能更易受到缺血損害，應(yīng)注意保護(hù)。

1 Hanke M，F(xiàn)arkas LM，Jakob M，et al.Heparin-binding epidermal growth factor like growth factor:a component in chromaffin granuleswhich promotes the survival of nigrostriatal dopaminergic neurones invitro and in vivo〔J〕.Neuroscience，2004;124(4):757-66.

2 Hermann PM，Nicol JJ，Nagle GT，et al.Epidermal growth factor-dependent enhancement of axonal regeneration in the pond snail Lymnaea stagnalis:role of phagocyte survival〔J〕.J Comp Neurol，2005;492(4):383-400.

3 戴 德，鐘艷秋.表皮生長(zhǎng)因子抑制小腦顆粒細(xì)胞凋亡的作用〔J〕.寧夏醫(yī)學(xué)雜志，2006;28(5):357-9.