張小果， 喬桂榮， 李翠云，3， 劉明英， 蔣 晶， 李海營， 邱文敏， 卓仁英

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310052；2.中國林業(yè)科學(xué)研究院 亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 富陽 311400；3.新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046）

旱柳Salix matsudana，又稱柳樹、河柳、江柳，是中國北方平原地區(qū)最常見的鄉(xiāng)土樹種之一，較耐寒，耐干旱，稍耐鹽堿，在含鹽量為2.50 g·kg-1的輕度鹽堿地上仍可生長[1]。目前，國內(nèi)外關(guān)于植物耐鹽性的研究主要集中在糧食作物（水稻Oryza sativa，小麥Triticum aestivum，玉米Zea mays等）和經(jīng)濟作物（大豆Glycine max，煙草Nicotiana tabacum，馬鈴薯Salanum tuberosum等），與草本植物相比，對木本植物的研究工作尚未得到充分展開[2]。20世紀90年代初，林木研究進入基因組時代；90年代末，許多林木研究實驗室建立了功能基因組學(xué)工具，這使得研究工作者可以同時分析大量的轉(zhuǎn)錄本或蛋白質(zhì)，從而為理解蛋白功能、基因調(diào)節(jié)等提供了機會[3]。蛋白質(zhì)是基因功能的最終執(zhí)行者，而轉(zhuǎn)錄水平所獲得的基因表達信息并不足以闡明基因的功能。因此，從翻譯水平上來研究蛋白質(zhì)的表達與功能模式是生命科學(xué)發(fā)展的必然趨勢[4]。雙向電泳是研究蛋白質(zhì)表達變化最有效的工具之一。它利用等電點和分子量2個性質(zhì)對蛋白質(zhì)進行分離，可以使得樣品中數(shù)千種蛋白得到有效分離[5]。雙向電泳技術(shù)面臨的挑戰(zhàn)是高分辨率和重復(fù)性[6]。只有具備了高分辨率和高重復(fù)性才能適用于接下來的凝膠圖片分析，蛋白點配對，找出差異蛋白。為建立旱柳根系雙向電泳體系，本研究從蛋白提取、染色及雙向電泳中蛋白上樣量、平衡時間、等電聚焦等方面對旱柳根部總蛋白雙向電泳體系進行分析比較，以建立優(yōu)化的試驗體系。

1 材料與方法

1.1 試劑

尿素（電泳級），安福靈（Ampholine）pH 3～10和碘乙酰胺購自GE醫(yī)療集團（美國）；丙烯酰胺（Acr），甲叉雙丙烯酰胺（Bis），十二烷基硫酸鈉（SDS），二硫蘇糖醇（DTT）購自默克（Merck，德國）；苯甲基磺酰氟（PMSF）， 3-[3-（膽酰氨丙基）二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽（CHAPS）， 考馬斯亮藍 G-250（CBB G-250）和甘氨酸購自Sigma（USA），β-巰基乙醇，聚乙烯吡咯烷酮（PVPP），三羥甲基氨基甲烷（Tris），乙二胺四乙酸二鈉鹽（EDTA-Na2），pH 8.0 Tris-飽和酚，曲拉通（Triton X-100），過硫酸銨和四甲基乙二胺 （TEMED） 等購自中國上海生工；丙酮，乙酸銨，甲醇，乙醇，磷酸，甘油，硫酸銨。均為分析純，購自中國上海生工。

1.2 植物材料

將從旱柳I-23無性系上剪下來的枝條剪成長為20.0 cm，徑為0.5～1.0 cm的規(guī)格插入泡沫板，置于水培箱用自來水進行水培生根。日間溫度為25～30℃，夜間為18～20℃，相對濕度為60%～80%，光照16 h·d-1。1個月后加入1/4倍的Hoagland營養(yǎng)液[7]。其后2周換1次營養(yǎng)液，期間不斷增加營養(yǎng)液強度直到1倍。3個月后，取水培苗根系提取總蛋白。

1.3 采用酚抽法提取蛋白

參照Wang[8]的方法。約1.0 g旱柳根置液氮中充分磨碎，加0.1 g聚乙烯吡咯烷酮繼續(xù)研磨，向研缽加入5 mL提取液（300mmol·L-1三羥甲基氨基甲烷，50mmol·L-1乙二胺四乙酸二鈉鹽，50mmol·L-1硼砂， 50mmol·L-1維生素 C， 10.0 g·kg-1曲拉通， 20.0 g·kg-1β-巰基乙醇， 0.7 mol·L-1蔗糖， 1mmol·L-1苯甲基磺酰氟），待其融化后繼續(xù)研磨，轉(zhuǎn)移到50 mL離心管；4℃，15000×g離心50 min，將上清液轉(zhuǎn)移到一干凈的50 mL離心管，加等體積的三羥甲基氨基甲烷-酚（pH 8.0）漩渦10 min，4℃，15000×g離心30 min；用1 mL槍小心吸取上層酚相至100 mL離心管中，加入5倍體積的-20℃預(yù)冷乙酸銨飽和甲醇，在-20℃冰箱放置6 h；15000×g，4℃，離心15 min，沉淀用預(yù)冷乙酸銨飽和甲醇沖洗1次，-80℃靜置5 min，取出后15000×g離心15 min，沉淀用體積分數(shù)為80%冷丙酮洗2遍，15 min·次-1。室溫干燥，所得干粉置-80℃保存待用。

1.4 蛋白質(zhì)的定量

雙向電泳時蛋白質(zhì)樣品的上樣量應(yīng)該盡量一致。因此，蛋白質(zhì)樣品的準確定量非常關(guān)鍵。本實驗采用經(jīng)典的 Bradford法[21-22]進行定量。

1.5 雙向電泳條件的建立

第一向等電聚焦使用pH 3～10 IPG（固定pH梯度）膠條（美國GE醫(yī)療集團）在 Ettan IPGphor電泳儀（Ettan IPGphor 3，美國GE醫(yī)療集團）上完成，一向采用膠內(nèi)水化方式上樣，二向采用125.0 g·kg-1的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）膠進行分離。

1.5.1 蛋白上樣量的比較 蛋白質(zhì)樣品的上樣量大小是影響凝膠圖譜的重要因素。本實驗采用24 cm，pH 3～10的線性IPG膠條，設(shè)計 600，900，1200 μg·膠條-1。采用的聚焦程序為500 V（1 h）→1000 V（3 h）→3000 V（4 h）→3000～8000 V （2 h）→維持電壓 8000 V， 使總聚焦伏特小時數(shù)為 11 萬 V·h， 以確定最佳上樣量。蛋白樣品用水化液補足至450 μL，沿著水化盤槽的邊緣從左至右線性加入樣品[9]。去除預(yù)制IPG膠條上的保護層，輕輕地將IPG膠條膠面朝下置于水化盤中的樣品溶液上，1 h后，用礦物油覆蓋，膠條泡脹14 h后，將IPG膠條轉(zhuǎn)移至Ettan IPGphor 3膠條槽。用去離子水將預(yù)制好的電極濾紙片濕潤，置于IPG膠條的末端，安裝電極，設(shè)定程序參數(shù)并開始運行。

1.5.2 平衡時間的比較 平衡的目的是使蛋白質(zhì)與十二烷基硫酸鈉充分相互結(jié)合，以確保第二向蛋白質(zhì)的分離。為了把握最佳的平衡時間及膠條中蛋白質(zhì)隨時間變化而丟失的情況，本研究采用兩步法，分別在含有二硫蘇糖醇和碘乙酰胺的平衡液中平衡 10，15，20和50 min來確定最佳平衡時間。采用的膠條為7 cm，pH 3～10線性膠條，上樣量為250 μg。 聚焦程序為250 V （30 min）500 V （1 h）1000 V（3 h）5000 V （9 h）500 V （30 min）。 配制平衡液 A：50mmol·L-1三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽 （pH 8.8）， 6 mol·L-1尿素,300 g·kg-1甘油,20 g·kg-1十二烷基硫酸鈉,0.02 g·L-1溴酚藍和 10 g·kg-1二硫蘇糖醇。 配制平衡液 B：50mmol·L-1三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽 （pH 8.8），6 mol·L-1尿素,300 g·kg-1甘油,20 g·kg-1十二烷基硫酸鈉,0.02 g·L-1溴酚藍和 25 g·kg-1碘乙酰胺。

1.5.3 最佳聚焦伏特小時 高電壓是等電聚焦過程中蛋白質(zhì)能否充分泳動到等電點的重要前提，直接關(guān)系到等電聚焦的效果。采用24 cm，pH 3～10的線性IPG膠條，上樣量為900 μg。設(shè)置的電泳程序為500 V（1 h）1000 V（3 h）3000 V（4 h）3000～8000V （2 h）維持電壓8000 V， 使總聚焦伏特小時數(shù)分別達到 6萬V·h，8萬V·h，10萬V·h后，斷開電源，取出膠條。

1.6 染色

采用改進的 “Blue Silver”考馬斯亮藍染色法[10，13]將凝膠立即置于固定液（體積分數(shù)為10%乙酸與體積分數(shù)為40%乙醇混合）固定1 h；再用超純水漂洗3次，10 min·次-1；然后將凝膠置于考馬斯亮藍染色液 （100.00 g·kg-1磷酸，體積分數(shù)為20%乙醇，100.00 g·kg-1硫酸銨，1.25 g·kg-1考馬斯亮藍 G-250）中染色14 h。用超純水脫色至背景清晰為止。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同染色方法的比較

考馬斯亮藍染色法、銀染法是較為常用的蛋白染色方法[11]。本研究對Candiano等[10]發(fā)明的 “Blue Silver”考馬斯亮藍染色法進行改進，具體就是將 “Blue Silver”考馬斯亮藍染色法中的甲醇用乙醇代替。通過跑單向的方法來鑒定其靈敏度。如圖1，所提蛋白從右向左對比稀釋，第1個泳道的量為10 μg，當(dāng)?shù)竭_第6個泳道時，銀染和改進的考染檢測效果均較低，說明采用改進的考馬斯亮藍染色方法靈敏度很高[14]。因此，在本雙向電泳體系中，染色方法采用改進的 “Blue Silver”考馬斯亮藍染色法。

圖1 不同染色方法的比較Figure 1 Comparison of different staining methods

2.2 雙向電泳條件對雙向電泳結(jié)果的影響

圖2 不同上樣量的雙向蛋白質(zhì)電泳圖譜Figure2 2-DE gel of different loading quantity

2.2.1 不同上樣量對蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜的影響 圖2為不同上樣量的雙向蛋白質(zhì)電泳圖譜，采用的是考染法。研究發(fā)現(xiàn)：隨著上樣量的增加并沒有呈現(xiàn)背景很重的現(xiàn)象。從圖譜上可以看到，蛋白點基本呈圓形。上樣量為 600，900和1200 μg，斑點檢測參數(shù)Smooth=3，Min Area=5，Saliency=10時，蛋白質(zhì)斑點數(shù)檢測結(jié)果分別是1241，1562和1599。如圖2凝膠圖譜中正方形框選區(qū)域放大圖，隨著上樣量的增加，獲得的低峰度蛋白點數(shù)目更多且清晰，但是當(dāng)上樣量從900 μg增加到1200 μg，蛋白點雖然有所增加，但增加不明顯，說明上樣量增加，高豐度蛋白質(zhì)的斑點過大，造成交叉、重疊，影響其他蛋白質(zhì)點的分離和分析。此外，由于上樣量增加，橫向條紋和縱向條紋明顯增加，如箭頭所指區(qū)域。這是由于上樣量過大使樣品溶液中的雜質(zhì)及離子含量增大，聚焦效果較差，影響蛋白點的有效分離，產(chǎn)生了很多假點，不能用于凝膠分析。因此，綜合考慮圖譜的分辨率和蛋白點的個數(shù)，對于24 cm，pH 3～10的線性IPG膠條，900 μg蛋白是其最佳的上樣量。

2.2.2 不同平衡時間對蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜的影響 從本研究看出：平衡10 min時蛋白質(zhì)斑點的分離效果較好，蛋白點基本成圓形，很少有拖尾現(xiàn)象，蛋白點不發(fā)散，說明平衡時間為10 min時，十二烷基硫酸鈉已經(jīng)與蛋白質(zhì)充分結(jié)合。當(dāng)總平衡時間大于等于30 min，如圖3中箭頭所示，蛋白點開始彌散，高豐度蛋白點面積變大，一些低分度蛋白點開始丟失，當(dāng)平衡平衡時間達到50 min(圖3 D)，蛋白點丟失嚴重，蛋白點不圓，呈雨滴狀。

2.2.3 不同聚焦時間對蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜的影響 等電聚焦時各蛋白質(zhì)到達各自的等電點所需要的時間與電泳的伏特小時數(shù)有關(guān)。因此，對于特定的膠條都有一個最小的聚焦伏特小時數(shù)，只有達到這一數(shù)值時才能保證各蛋白質(zhì)到達各自的等電點，當(dāng)上樣量為900 μg，聚焦6萬 V·h，8萬V·h，電泳圖譜存在輕微的橫紋，且高豐度蛋白區(qū)域蛋白點彌散，蛋白沒有充分聚焦；當(dāng)聚焦時間增加到10萬V·h，橫向條紋明顯減少，且從圖4中框選部分的放大圖可以看出，蛋白點不彌散，蛋白點成圓形，說明聚焦充分，大部分蛋白質(zhì)都運動到自身相應(yīng)的等電點。因此，實驗針對24 cm，pH 3～10的膠條，上樣量900 μg時，10萬V·h是其最佳聚焦伏特小時數(shù)。

圖3 不同平衡時間的雙向蛋白質(zhì)電泳圖譜Figure3 Comparison of different equilibrium time

圖4 不同等電聚焦時間的雙向蛋白質(zhì)電泳圖譜Figure4 Comparison of different IEF time

2.3 鹽堿脅迫對旱柳根蛋白質(zhì)成分的影響

分離全蛋白質(zhì)的2個關(guān)鍵參數(shù)是其分辨率和可重復(fù)性[6]。為了使得雙向蛋白質(zhì)電泳圖譜有很高的重復(fù)性，便于凝膠與凝膠之間的匹配，就要保證從蛋白提取到二向電泳整個流程中操作的一致性，從而減少實驗結(jié)果分析時引起的誤差。本研究采用24 cm，pH 3～10線性IPG膠條，最佳雙向電泳條件：上樣量900 μg，平衡時間10 min，聚焦時間10萬V·h。對相同材料分次提取蛋白并進行雙向電泳的結(jié)果進行了比較，結(jié)果如圖5 A和圖5 B?？梢钥闯觯和粯悠贩执翁崛〉碾p向電泳圖譜中蛋白分布及豐度表現(xiàn)出良好的重復(fù)性，利用ImageMaster 2D Platinum 6.0軟件分析凝膠上蛋白點數(shù)量和豐度基本一致，當(dāng)斑點檢測參數(shù)Smooth=3，Min Area=5，Saliency=10時，圖5 A圖5 B的蛋白點數(shù)分別為1464，1448，匹配率達83.035%，說明本研究建立的蛋白提取及雙向電泳體系重復(fù)性、穩(wěn)定性強，分辨率也很高。

圖5 同一樣品的2次雙向蛋白質(zhì)電泳圖譜Figure5 Reproducibility of 2-DE for the same sample

圖6 對照及鹽脅迫24 h后雙向電泳圖Figure6 2-DE maps of the control and salt-stress after 24 h

水培3個月的旱柳，當(dāng)苗根長10 cm左右時，用于鹽處理，即向1/4 Hoagland營養(yǎng)液中加入最終濃度為100mmol·L-1的氯化鈉做為鹽脅迫組。同時，選擇生長狀況一致的旱柳置于1/4 Hoagland營養(yǎng)液作為對照。在鹽脅迫24 h后，提取旱柳根總蛋白，采用如上建立的雙向電泳體系進行試驗，經(jīng)過雙向電泳，考染，獲得蛋白質(zhì)圖譜（圖6）。從圖6中可以看出堿性端蛋白點較少，大部分蛋白集中在酸性端。說明旱柳根部蛋白質(zhì)大部分屬于酸性蛋白。采用ImageMaster 2D Platinum 6.0軟件結(jié)合肉眼對圖譜進行分析可以看出：鹽脅迫條件下蛋白圖譜與對照條件下蛋白圖譜具有一定相似性，但也存在差異性。在鹽脅迫后，所表達的蛋白點數(shù)有所增加，且存在一些表達量上的差異（圖7～9），通過軟件自動匹配及數(shù)據(jù)分析。當(dāng)斑點倍率關(guān)系系數(shù)大于1.5時，顯示92個差異點，對每一個點進一步手動篩選，假點及錯配蛋白點不予考慮，結(jié)果顯著差異的點有39個，其中15個下調(diào)，24個上調(diào)（11個新誘導(dǎo)表達）。

3 討論

蛋白質(zhì)雙向電泳分離技術(shù)是一個受多種因素影響的多步驟實驗，只有處理好蛋白質(zhì)的分離純化、溶解和變性、雜質(zhì)的去除、膠條的水化、蛋白質(zhì)的等電聚焦、膠條的平衡、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、染色，才有可能獲得較高重現(xiàn)性、可比性和穩(wěn)定性的圖譜，蛋白質(zhì)雙向電泳分離的實驗條件才算成功建立[15]。

蛋白質(zhì)樣品制備是雙向電泳的關(guān)鍵步驟，它的好壞直接決定著雙向電泳的分辨率、重復(fù)性。如何去除影響蛋白質(zhì)可溶性和雙向電泳重復(fù)性的物質(zhì)（如核酸、脂類和多糖等生物大分子以及鹽類小分子）很重要。不同植物材料所含的糖類、脂肪、色素等物質(zhì)可能有所不同，因此，要對蛋白提取方法進行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整才能達到好的分離效果[16]。飽和酚-甲醇醋酸銨法通過不同相選擇性溶解，能有效去除有機物雜質(zhì)。在樣品制備過程中，蛋白質(zhì)和脂類溶于酚相，鹽、核酸、多酚和多糖等可溶性物質(zhì)進入水相。由于酚的脂溶性，酚提取法非常有利于膜蛋白的提取，而膜蛋白往往與植物的耐鹽性密切相關(guān)[17]。由于純丙酮沉淀的蛋白復(fù)溶性差，最后一定要用體積分數(shù)為80%的冷丙酮去清洗蛋白。從電泳圖中可以看出用酚抽法提取的蛋白質(zhì)穩(wěn)定，幾乎沒有條紋和拖尾等紋理現(xiàn)象，得到了清晰的電泳圖譜，說明此方法適于旱柳根部蛋白質(zhì)的提取。

考馬斯亮藍染色可以說是目前使用最為廣泛的一種方法。考馬斯亮藍染色主要具有以下一些優(yōu)點：一是線性范圍寬，適于進行定量分析；二是操作步驟簡單；三是顯色時間好掌握；四是與質(zhì)譜的兼容性好[23]。銀染法雖然可以檢測納克級水平上的蛋白，但蛋白質(zhì)的量和染色強度之間線性關(guān)系范圍很窄,使得銀染并非一種非?？煽康牡鞍踪|(zhì)定量方法；并且由于其實驗步驟復(fù)雜，與質(zhì)譜配伍性較差，不利蛋白點的成功鑒定[12]。由于考染法突出的優(yōu)點，而銀染法弊端多，因此，在對這2種染色方法的單向電泳染色結(jié)果簡單比較后，本實驗體系染色方法選擇了改進的 “Blue Silver”考馬斯亮藍染色法。在秦慧[13]的文章中也提到，用乙醇代替甲醇，檢測效率沒有降低，可檢測達幾納克水平的蛋白。

上樣量的大小直接影響雙向電泳的分辨率。上樣量過低，豐度較低的蛋白無法顯現(xiàn)，上樣量過高，蛋白無法有效分離。上樣量的大小因上樣方式、IPG膠條的pH梯度及膠條長度等差異而各不相同，最佳的上樣量需根據(jù)具體實驗的對象來探索確定[3]。窄pH梯度的IPG膠條比寬pH梯度的IPG膠條需更大的上樣量，考馬斯亮藍染色比銀染需要的上樣量大，提高蛋白質(zhì)的上樣量有利于低豐度蛋白的檢測，但上樣量過高可導(dǎo)致高豐度蛋白斑點掩蓋低豐度蛋白斑點。且樣品中含有鹽離子，上樣量越大鹽離子濃度也越大，影響電壓的上升，達到高電壓的時間更長，易產(chǎn)生橫向條紋，橫條紋是樣品中鹽離子濃度較高的一個顯著特征[18]。

圖7 雙向電泳分析后的參考膠Figure7 Referance gel afer two-dimensional electrophoresis gel analysis

圖8 脅迫后表達下調(diào)Figure8 Protein expression down-regulate

圖9 脅迫后蛋白表達上調(diào)Figure9 Protein expression up-regulate

在本實驗體系中，采用7 cm的膠條驗證蛋白隨平衡時間變化的丟失情況，根據(jù)伯樂雙向電泳流程報道，平衡過程導(dǎo)致蛋白丟失約5%～25%，還會使分辨率降低，平衡30 min時，蛋白帶變寬40%，所以平衡時間不可過長。平衡時間要充分長（至少2×10 min），但也不要超過（2×15 min），7 cm的膠條雙向電泳結(jié)果也說明了這一點。

聚焦情況也會對電泳結(jié)果有明顯的影響，不完全聚焦會造成蛋白水平和垂直方向的拖尾。但聚焦也并不是越長越好，過量的聚焦會導(dǎo)致最終膠圖上堿性端橫條紋的產(chǎn)生[19-20]。

目前，開展木本植物的蛋白質(zhì)組研究，確定各蛋白質(zhì)的功能、蛋白質(zhì)之間的相互作用研究，對于闡明木本植物的生長發(fā)育機制、抗逆機制及遺傳育種都具有重要的理論意義和實用價值。本實驗采用改進的苯酚法，提高了蛋白質(zhì)提取質(zhì)量，再用考染的染色方法，確定了考染的最佳上樣量，平衡時間，等電聚焦時間，從而建立了一套較完整的旱柳雙向電泳研究體系。本研究以優(yōu)化的雙向電泳體系對鹽脅迫處理的旱柳根蛋白分離，獲得分辨率較高的雙向蛋白質(zhì)電泳圖譜，并獲得了39個差異點，目前，我們已經(jīng)對這些差異蛋白進行了質(zhì)譜鑒定，有30個蛋白點鑒定成功。其中已知的蛋白有過氧化物酶、乙烯誘導(dǎo)蛋白、激動蛋白等，但大部分蛋白是預(yù)測蛋白或未知蛋白。我們正在結(jié)合旱柳根系鹽堿脅迫的表達譜芯片對這些蛋白做進一步分析，期望闡明旱柳適應(yīng)鹽逆境脅迫的分子機制，分離出旱柳耐鹽的關(guān)鍵基因，為林木抗逆性遺傳改良提供支撐。

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