劉 彤,李 哲,畢曉穎

(1.吉林大學白求恩醫(yī)學院 細胞生物學教研室,吉林長春130021;2.吉林大學公共衛(wèi)生學院衛(wèi)生毒理學教研室)

線粒體是細胞的重要細胞器,它在細胞能量代謝、自由基生成、蛋白質磷酸化,尤其是在細胞凋亡過程中起核心調控作用[1]。Science于1999年發(fā)表了“Mitochondrial make a comeback”專題系列論文[2],重申線粒體再度成為當今生命科學和分子醫(yī)學中的熱點和前沿。線粒體功能缺陷可引起神經(jīng)肌肉疾病、心血管病、糖尿病、帕金森氏病和腫瘤學等多種疾病,分離線粒體對于我們理解線粒體功能障礙與相關疾病的機制有重要作用。但是,針對新生大鼠腦組織中線粒體的分離和特性分析的描述還不全面。因此,本實驗的目的就是建立一個方法,用來快速的對新生大鼠腦組織中的線粒體進行分離,并為其特性分析奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 新生大鼠6只、超速離心機、電子顯微鏡、天平、動物手術器械、勻漿器

1.2 試劑 0.25M蔗糖、0.5 mM K+-EDTA、10 mM Tris-HCl、10mg/ml牛的血清白蛋白、用線粒體緩沖液稀釋的濃度分別為12%、26%、40%的Percoll、2.5%戊二醛、2%四氧化鋨、乙醇、丙烯氧化物、樹脂。

1.3 方法

1.3.1 線粒體的分離

(1)迅速摘取新生大鼠的腦,稱重400-500 mg,移入冰冷的線粒體分離緩沖液(0.25 M蔗糖,0.5 mM K+-EDTA 10mM Tris-HCl,pH=7.4)中 ,在實驗過程中所有的儀器和緩沖液都要保持冰冷(4℃),每個腦都分離出左右半球,并保證每個樣品中都含有左右腦組織。

(2)每個樣品在3.6 ml 12%的Percoll中攪勻,用直徑為0.12 mm的勻漿器攪拌10次,再用直徑為0.06 mm的勻漿器攪拌10次。

(3)在離心管中先鋪一層1.2 ml 40%的Percoll,再鋪一層1.2 ml 26%的Percoll,然后取上述攪拌好的樣品1.2 ml鋪在最上層。

(4)將離心管超速離心19 000轉5分鐘,棄去上清,取中層液體并將其1∶4稀釋在線粒體緩沖液中,再超速離心14 000轉10分鐘,將沉淀稀釋在1 ml線粒體緩沖液中,超速離心14 000轉5分鐘,最后將沉淀溶于100微升線粒體緩沖液中。

1.3.2 線粒體的電鏡觀察

(1)將管中一二三層的液體都固定在2.5%的戊二醛中,每個樣品用0.1 M的磷酸鹽緩沖液(150 mM磷酸氫二鈉,100mM氫氧化鈉,PH7.4)洗三次共十分鐘,然后在2%四氧化鋨中固定1小時。

(2)每個樣品再用0.1M的磷酸鹽緩沖液洗三次 ,在濃度分別為 25%、50%、85%、95%、100%的乙醇溶液中脫水十分鐘。

(3)每個樣品再在丙烯氧化物中深度脫水十分鐘,然后在1∶1的丙烯氧化物和樹脂混和物中滲透兩小時,然后在1:2的丙烯氧化物和樹脂混和物中過夜。

(4)最后將樣品包埋入樹脂中70℃過夜,電鏡觀察線粒體。

2 結果

2.1 線粒體的分離

Percoll密度梯度離心提供獲得高純度腦組織線粒體的最佳方法,Percoll密度梯度中的三種濃度的電鏡照片見圖1。在此研究中改變Percoll密度梯度條件可影響線立體的分離純度和產(chǎn)率。中層Percoll濃度在20%-24%時,超速離心后可以看見在中層(26%)和底層(40%)之間有一條很淺的帶。電子顯微鏡下觀察這一條帶含有除線立體外的其他細胞成分。在中層使用26%的Percoll可以去除這一層并使中層得到產(chǎn)率更高的線粒體。

2.2 線粒體的電鏡觀察

分離第二層線粒體超微結構見圖2。利用上述方法分離出新生大鼠腦組織中的線粒體,電鏡觀察線粒體的超微結構形態(tài)具有完整的線粒體外膜和發(fā)育良好的線粒體嵴,線粒體的密度很高且形狀不同,呈球形和橢圓形。在所有的線粒體樣品中,中層Percoll濃度在20%-24%時,觀察發(fā)現(xiàn)約有90%為線粒體。

圖1 不同濃度Percoll的線粒體分離圖

圖2 線粒體超微結構

3 討論

線粒體是許多重金屬毒作用的靶細胞器,研究線粒體功能的改變對于探討重金屬對神經(jīng)系統(tǒng)的損傷作用機制具有重要的意義。許多研究者已經(jīng)報道了從成人腦組織分離線粒體的不同方法,但是對新生兒腦組織中的線粒體分離方法卻描述甚少。

最初,我們曾用Ficoll梯度來分離線粒體,線粒體純度較低,后來,我們改用Percoll密度梯度離心法從新生腦組織中分離線粒體,結果獲得了高純度和產(chǎn)率的線粒體。本實驗從新生大鼠腦組織中分離線粒體,并對其特性做出了詳盡的分析和闡述。使用Percoll梯度法來分離新生大鼠腦組織中的線粒體是一種快速有效的方法[3-5],它可以得到純度和產(chǎn)率較高的線粒體。并通過電子顯微鏡對新生大鼠腦組織中的線粒體進行形態(tài)觀察得以驗證。

在成年大鼠腦組織線粒體的制備中,大多數(shù)線粒體沉淀在了第三層(Percoll26%-40%)。在新生大鼠腦組織線粒體的制備中,使用相同的密度梯度離心,大多數(shù)線粒體沉淀在了第二層(Percoll12%-26%)。這個不同之處可能是因為沉淀系數(shù)不同以及成年大鼠和新生大鼠線粒體中細胞成分的密度不同所致。調整中層 Percoll的濃度,調為20%-24%,結果發(fā)現(xiàn)在第三層中的線粒體增多,而這一層含有除線粒體以外的其他細胞成分。本實驗顯示成年大鼠和新生大鼠腦組織中的線粒體有明顯的不同。

從新生大鼠腦組織中分離出的線粒體在電子顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)其大小和形狀并不相同。絕大多數(shù)的線粒體很小(0.5-1微米),形狀有橢圓形和球形。此形態(tài)與成年大鼠腦組織中的線粒體的表現(xiàn)一致。但一些線粒體被破壞了,能夠看見其形態(tài)但是缺乏線粒體嵴。如果在腦組織攪拌過程中減少攪拌次數(shù)可以降低線粒體的破壞率,但是細胞破裂不完全使細胞沉淀在第二層。

綜上所述,這些結果顯示使用Percoll密度梯度離心的方法可以成功地從新生大鼠腦組織中分離出線粒體,為新生大鼠腦組織中線粒體功能研究提供一個實用的模型。

[1]Cassarino DS,Bennett JP.An evaluation of the role of mitochondria in neurodegenerative diseases:mitochondrial mutations and oxidative pathology,protective nuclear responses,and cell death in neurodegeneration,Brain Res[J].Brain Res Rev,1999,(29):1.

[2]Kibertis PA.Mitochondrial makes a comeback[J].Science,1999,283:1475.

[3]Truscott KN,Fanner NP.Import of carrier proteins into mitochondria[J].Biol Chem,1999,380:1151.

[4]Sims NR,Anderson MF.Isolation of mitochondria from rat brain using Percoll density gradient centrifugation[J].Nat Protoc,2008,3(7):1228.

[5]Dunkley PR,Jarvie PE,Robinson PJ.A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes[J].Nat Protoc,2008,3(11):1718.