劉宏偉 彭淑玲 周 毅 張士賢 張海娟

干眼癥是眼科門診的常見病和多發(fā)病，臨床上主要采用物理治療、局部藥物治療、手術(shù)治療和全身藥物治療等，一般來(lái)說(shuō)不能將其治愈，只能緩解臨床癥狀。杞菊地黃丸出自清代董西園的《醫(yī)級(jí)寶鑒》，用于治療肝腎陰不足引起的兩眼昏花、視物模糊、眼睛干澀等，是在六味地黃丸的基礎(chǔ)上加枸杞子和菊花2味中藥而成。枸杞子和菊花有補(bǔ)肝腎，明目的作用。我們受此方劑的啟發(fā)，研制出杞菊滴眼液，它由枸杞子、野菊花、黃精和薄荷腦4味藥組成，我們對(duì)其促進(jìn)家兔淚液分泌、減輕大鼠角膜損傷的作用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

家兔20只，為新西蘭兔，普通級(jí)動(dòng)物，體重（2.1±0.3） kg，兔齡為 8 周，動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK（京）2006-0025。大鼠40只，為Wister大鼠，無(wú)特殊病原體級(jí)動(dòng)物，體重（151±13） g，鼠齡為 6 周，動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK（京）2008-0021。均購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

1.2.1 實(shí)驗(yàn)藥品：杞菊滴眼液、溶劑對(duì)照品（北京宏泰康達(dá)醫(yī)藥科技有限公司）；0.2%卡波姆滴眼液（博士倫公司）；0.5%羧甲基纖維素鈉滴眼液（愛力根愛爾蘭制藥公司）；0.5 mg/ml阿托品注射液（天津金耀氨基酸有限公司）；1%苯扎溴銨溶液（5%苯扎溴銨溶液加生理鹽水稀釋）、2%熒光素鈉溶液（北京同仁醫(yī)院）、0.4%鹽酸奧布卡因滴眼液（日本參天制藥株式會(huì)社）。

1.2.2 杞菊滴眼液的制備：枸杞子、黃精加80%的乙醇回流2次，濾過(guò)；藥渣與野菊花混合，加水浸泡24 h，煎煮3次，濾過(guò)，得藥液一；另取薄荷腦、0.5 g吐溫-80，加水適量，研磨使溶解，為藥液二；將藥液一、二混勻，加入0.02 g硫柳汞、0.1 mol/L氫氧化鈉、磷酸鹽緩沖液、8.5 g氯化鈉，加水至1 000 ml，高壓濕熱滅菌，濾過(guò)，灌裝，即得。

1.2.3 溶劑的制備：取0.5g吐溫-80，加水適量，研磨，加入0.02 g硫柳汞、0.1 mol/L氫氧化鈉、磷酸鹽緩沖液、8.5 g氯化鈉，加水至1 000 ml，高壓濕熱滅菌，濾過(guò)，灌裝，即得。

1.3 實(shí)驗(yàn)材料

schirmer測(cè)定濾紙、無(wú)菌注射器、秒表（schirmer試驗(yàn)測(cè)定時(shí)間用）、手術(shù)鑷、手術(shù)剪、裂隙燈顯微鏡。

1.4 觀察杞菊滴眼液對(duì)干眼癥家兔淚液分泌的影響

1.4.1 制作動(dòng)物模型：參照Burgalassi淚腺注射阿托品的方法進(jìn)行淚液分泌低下干眼癥的造?！?〕。20只家兔雙眼滴0.4%鹽酸奧布卡因滴眼液，下淚腺注射阿托品 0.25 ml/眼（0.5 mg/ml），0.5 小時(shí)后進(jìn)行schirmer試驗(yàn)，結(jié)果較造模前減少（P＜0.05），說(shuō)明造模成功。予每日雙眼下淚腺注射阿托品4次，連續(xù)7天。

1.4.2 分組治療：將20只家兔按第1次注射阿托品后schirmer試驗(yàn)結(jié)果分為5組，每組4只，使各組的schirmer試驗(yàn)值基本相同，分組后即刻進(jìn)行治療。5組分別為溶劑對(duì)照組（陰性對(duì)照）、卡波姆滴眼液組（陽(yáng)性對(duì)照）、杞菊滴眼液低、中、高劑量組。分組后雙眼即刻予相應(yīng)滴眼劑。溶劑對(duì)照組予溶劑，4次/日；卡波姆滴眼液組予0.2%卡波姆滴眼液，2次/日；杞菊滴眼液低劑量組予杞菊滴眼液，2次/日；中劑量組予杞菊滴眼液，4次/日；高劑量組予杞菊滴眼液，8次/日。共治療7天。

1.4.3 淚液分泌的測(cè)量：schirmer試驗(yàn)測(cè)定時(shí)間為2分鐘。在造模前、第1次注射阿托品后0.5小時(shí)、第3、7天當(dāng)日第 1次注射阿托品后 0.5小時(shí)進(jìn)行schirmer試驗(yàn)。

1.5 觀察杞菊滴眼液對(duì)干眼癥大鼠角膜的作用

1.5.1 制作動(dòng)物模型：用摘除淚腺、滴加苯扎溴銨溶液的方法制備大鼠角膜損傷干眼癥模型。大鼠耳前皮膚去毛、消毒，滴0.4%鹽酸奧布卡因滴眼液，用手術(shù)鑷夾住耳前皮膚，手術(shù)剪在皮膚上剪一小口，剝離并摘除雙側(cè)淚腺〔2〕，雙眼滴1%苯扎溴銨溶液，第2天觀察角膜情況。

1.5.2 分組治療：將40只大鼠根據(jù)角膜染色評(píng)分結(jié)果分為5組，每組8只，使各組的角膜染色評(píng)分值基本相同，5組分別為溶劑對(duì)照組（陰性對(duì)照）、羧甲基纖維素鈉滴眼液組（陽(yáng)性對(duì)照）、杞菊滴眼液低、中、高劑量組，雙眼予相應(yīng)滴眼劑治療。其中羧甲基纖維素鈉滴眼液組予0.5%羧甲基纖維素鈉滴眼液，4次/日；其余4組用藥情況同1.4.2。造模后第2天開始用藥，治療21天。

1.5.3 角膜熒光素染色檢查及評(píng)分：大鼠雙眼滴2%熒光素鈉溶液，不沖洗，用裂隙燈顯微鏡進(jìn)行觀察。角膜上皮無(wú)染色，0分；染色面積＜25%，1分；染色面積為25%～50%，2分；染色面積為50%～75%，3分；染色面積＞75%，4分。在治療第7、14和21天檢查并記錄角膜病變情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 11軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。家兔造模前、后schirmer試驗(yàn)結(jié)果比較采用t檢驗(yàn)；各組家兔不同時(shí)期schirmer試驗(yàn)結(jié)果比較，以及各組大鼠不同時(shí)期角膜熒光素染色評(píng)分的比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 杞菊滴眼液對(duì)家兔淚液分泌的影響

造模前家兔的schirmer試驗(yàn)值為 （8.61±2.95）mm（n=40），第1次注射阿托品后0.5小時(shí)減少為（5.17±3.00）mm，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。schirmer試驗(yàn)值平均減少40.0%，說(shuō)明淚腺注射阿托品可以抑制家兔淚液分泌。

家兔造模前及第1次注射阿托品后0.5小時(shí)，各組間的schirmer試驗(yàn)值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。治療后第3天，卡波姆滴眼液組與溶劑對(duì)照組相比，Schirmer試驗(yàn)值增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；杞菊滴眼液各組與卡波姆滴眼液組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。治療后第7天，杞菊滴眼液中、高劑量組Schirmer試驗(yàn)值均較溶劑對(duì)照組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；杞菊滴眼液各組與卡波姆滴眼液組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

表1 各組干眼癥家兔眼 Schirmer試驗(yàn)結(jié)果（mm，±s，n=8）

表1 各組干眼癥家兔眼 Schirmer試驗(yàn)結(jié)果（mm，±s，n=8）

注：①造模前及第1次注射阿托品后，各組間比較，P＞0.05；②與溶劑對(duì)照組相比P＜0.05；③杞菊滴眼液各組與卡波姆滴眼液組相比，P＞0.05。

組別 造模前 第1次注射阿托品后 治療3天 治療7天溶劑對(duì)照組 8.40±3.67① 5.30±3.40① 3.45±2.25 3.40±2.07卡波姆滴眼液組 7.50±1.84① 5.35±1.75① 5.60±2.13② 6.40±2.41杞菊滴眼液低劑量組 8.00±2.00① 4.85±1.76① 5.20±2.54③ 6.30±1.89③杞菊滴眼液中劑量組 10.50±5.08① 5.35±4.44① 4.80±2.86③ 8.30±5.79②③杞菊滴眼液高劑量組 8.65±2.17① 5.00±3.66① 4.50±1.43③ 8.10±5.51②③

2.2 杞菊滴眼液對(duì)大鼠角膜的作用

治療前及治療7天，大鼠各組間角膜染色評(píng)分的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；治療14天，杞菊滴眼液低、中、高劑量組的角膜染色評(píng)分顯著低于溶劑對(duì)照組（P＜0.05）；杞菊滴眼液高劑量組角膜染色評(píng)分顯著低于羧甲基纖維素鈉滴眼液組（P＜0.05）；杞菊滴眼液低、中劑量組的角膜染色評(píng)分與羧甲基纖維素鈉滴眼液組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；治療21天，杞菊滴眼液低、中、高劑量組和羧甲基纖維素鈉滴眼液組的角膜染色評(píng)分均低于溶劑對(duì)照組（P＜0.05），杞菊滴眼液各組與羧甲基纖維素鈉滴眼液組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表 2）。

表2 大鼠角膜損傷修復(fù)的結(jié)果（±s，n=16）

表2 大鼠角膜損傷修復(fù)的結(jié)果（±s，n=16）

注：①各組間相比，P＞0.05；②與溶劑對(duì)照組相比，P＜0.05；③與羧甲基纖維素鈉滴眼液組相比，P＜0.05；④與羧甲基纖維素鈉滴眼液組相比，P＞0.05。

組別 治療前 治療7天 治療14天 治療21天溶劑對(duì)照組 3.13±1.36① 2.00±1.03① 2.06±0.68 1.38±0.96羧甲基纖維素鈉滴眼液組 3.00±1.10① 2.06±1.18① 1.81±0.91 0.81±0.66②杞菊滴眼液低劑量組 2.94±1.24① 1.63±0.62① 1.44±0.63②④ 0.68±0.60②④杞菊滴眼液中劑量組 3.13±0.96① 1.87±0.72① 1.38±0.50②④ 0.43±0.51②④杞菊滴眼液高劑量組 3.06±0.93① 2.00±0.63① 1.25±0.44②③ 0.56±0.51②④

3 討論

干眼癥患者大多有肝腎陰虛的癥狀，治療原則為“補(bǔ)肝明目”，因此設(shè)計(jì)使用杞菊滴眼液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察。杞菊滴眼液由4味中藥組成，君藥為枸杞子，主治肝腎陰虛、視力模糊或干澀眼痛，歸肝、腎、肺經(jīng)，可以滋腎、養(yǎng)肝、明目。臣藥為野菊花，性微寒、味辛、苦，歸肝、心經(jīng)，清熱解毒。佐藥為黃精，性平、味甘，歸脾、肺、腎經(jīng)，滋陰潤(rùn)肺、補(bǔ)脾益氣、滋腎填精，既能補(bǔ)中益氣，又能養(yǎng)陰益精，與枸杞子、野菊花并用，陰陽(yáng)互根，以滋陰補(bǔ)氣。使藥為薄荷腦，味辛性涼，具有疏風(fēng)、清熱、解毒等功效。

臨床對(duì)干眼癥診斷有多項(xiàng)測(cè)定指標(biāo)，如schirmer試驗(yàn)、虎紅染色、淚膜破裂時(shí)間、瞬目次數(shù)、角膜熒光素染色等方法。干眼癥的主要臨床癥狀為淚液分泌減少和角膜上皮損傷，對(duì)于實(shí)驗(yàn)性干眼癥的研究，可選一個(gè)主要指標(biāo)研究藥物的有效性和比較不同藥物作用的區(qū)別，本實(shí)驗(yàn)采用schirmer試驗(yàn)和角膜熒光素染色作為觀察指標(biāo)。

在對(duì)滴眼液藥效的研究中，多先固定每日的用量和頻次，檢驗(yàn)不同濃度藥物的效果，最終確定最佳的藥物濃度。本次實(shí)驗(yàn)中藥物的有效濃度已確定，主要觀察不同頻次對(duì)療效的影響。

淚腺，主要由交感和副交感神經(jīng)支配，是漿液性淚液的主要來(lái)源，抑制其作用可減少淚液分泌。Suwanapichon將肉毒毒素注射至大鼠淚腺，使淚液分泌減少〔3〕，大鼠全身注射東莨菪堿也可造成淚液減少〔4〕。兔的淚腺位于眶內(nèi)，分為上淚腺和下淚腺，上淚腺位于眶內(nèi)上眶壁內(nèi)，起于鼻側(cè)，止于上眶壁的中部，下淚腺位下眶壁內(nèi)，起于鼻側(cè)，止于顳側(cè)。我們將阿托品注射至兔下淚腺的部位，其2分鐘的schirmer平均值由8.61 mm下降為5.17 mm，前后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明該方法可達(dá)到抑制淚液分泌的目的。之后對(duì)實(shí)驗(yàn)家兔不斷注射阿托品，使淚液分泌維持在低水平狀態(tài)，治療后第7天，杞菊滴眼液中、高劑量組Schirmer試驗(yàn)值均較溶劑對(duì)照組增加（P＜0.05），提示杞菊滴眼液對(duì)淚液分泌有促進(jìn)作用。

大鼠淚腺分為眶內(nèi)淚腺和眶外淚腺，眶內(nèi)淚腺是哈德腺（Harderian gland），眶外淚腺是漿液腺，位于耳前皮下。將大鼠的眶外淚腺摘除，可造成淚液分泌減少，F(xiàn)ujihara 等〔2〕報(bào)道 schirmer試驗(yàn)下降 50%，我們的結(jié)果是下降60%～80%（另文發(fā)表）。淚液分泌減少，角膜可出現(xiàn)潰瘍〔5〕，但角膜潰瘍一般出現(xiàn)在干眼癥的后期。我們?cè)谡笫鬁I腺后，使用苯扎溴銨溶液造成大鼠角膜損傷，模擬干眼癥的上皮病變。由于淚腺摘除，使角膜上皮的修復(fù)延遲，有利于藥物治療作用的觀察。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，杞菊滴眼液治療14天和21天后，各劑量組大鼠角膜染色評(píng)分均低于溶劑對(duì)照組（P＜0.05），說(shuō)明其對(duì)角膜上皮修復(fù)有促進(jìn)作用，而角膜上皮修復(fù)是干眼癥治療的重要內(nèi)容〔6〕，考慮其作用與藥物中所含的豐富多糖、脂肪、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素和礦物質(zhì)等有關(guān)，它們對(duì)組織的修復(fù)是有益的。羧甲基纖維素鈉滴眼液對(duì)治療角膜上皮損傷也有效，可能由于它的粘稠性使眼表保留部分淚液，而淚液中含有表皮生長(zhǎng)因子（EGF）等〔7〕，從而促使角膜上皮修復(fù)。

本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果提示，杞菊滴眼液能增加淚液分泌和促進(jìn)修復(fù)角膜損傷，有利于緩解干眼癥的臨床癥狀，有治療干眼癥的作用，且為中藥制劑，患者可安全地使用。

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