史晨悅,阮玲琴,馮依慧,方嘉霖,宋晨驕,袁張根,丁悅敏,2
(1.浙江大學(xué)城市學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 杭州 310015;2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理系,浙江 杭州 310058)
近年來隨著我國高空作業(yè)事故、交通事故及地質(zhì)災(zāi)害的頻繁發(fā)生,脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)患者逐年增多。SCI最終??蓪?dǎo)致受損脊髓節(jié)段以下肢體運動和感覺能力的喪失,即發(fā)生癱瘓,給家庭和社會帶來極大的負擔。而長期以來SCI的治療一直是個難題,近年來干細胞移植治療給脊髓損傷后的功能修復(fù)帶來了新希望,是最近SCI修復(fù)研究的熱點之一[1]。骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一種多功能干細胞,具有多潛能性,MSCs移植治療研究已經(jīng)涉及脊髓損傷、多發(fā)性硬化、帕金森病和阿爾茨海默病等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病[2]。動物實驗和臨床研究均表明,MSCs移植治療SCI后,MSCs可分化為神經(jīng)樣細胞或分泌神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì),促進損傷脊髓修復(fù)和神經(jīng)功能恢復(fù)[3]。可見MSCs移植是SCI修復(fù)治療中的一種有效手段。但需要指出的是,在干細胞治療的移植載體選擇和植入方式等方面尚存在許多問題。
海藻酸鈉(sodium alginate,SA)是褐藻中普遍存在的酸性多糖,在二價陽離子存在條件下可交聯(lián)形成網(wǎng)狀水凝膠。該凝膠具有很好的親水性,營養(yǎng)物質(zhì)易于滲透擴散,且其酶解產(chǎn)物對細胞無毒害作用,故在組織工程研究中日益受到重視[4]。近來已經(jīng)有研究者研究了海藻酸鈉對MSCs的生物學(xué)效應(yīng)[5-6],將海藻酸鈉作為細胞移植的載體用于脊髓損傷的治療,并觀察到運動功能的恢復(fù)[7]。但生物材料在使用前都需要進行滅菌處理,由于海藻酸鈉受熱不穩(wěn)定[8],經(jīng)過滅菌后其理化性質(zhì)可能會發(fā)生改變,這種改變也可能會影響細胞的活性。海藻酸鈉作為細胞移植載體,其制備方法的不同,對MSCs的生物學(xué)特性帶來的影響及其在SCI治療中的效果尚未見報道。
1.1 藥品與試劑 海藻酸鈉(SA)和四甲基偶氮唑藍(MTT)購自美國sigma公司。胎牛血清,DMEM培養(yǎng)基,胰酶購自美國Gibco公司。神經(jīng)絲NF-200抗體,F(xiàn)ITC抗兔熒光二抗購自博士德生物工程公司。
1.2 海藻酸鈉凝膠制備 分別以生理鹽水和去離子水作為海藻酸鈉的溶劑,比較海藻酸鈉凝膠的溶解性。具體方法為:先稱取海藻酸鈉粉末,將粉末緩緩加入裝有少量溶劑的離心管中,同時邊加粉末邊加剩余溶劑,最后用旋渦混合器震蕩5 min后55℃水浴加熱過夜。為比較不同滅菌方法對海藻酸鈉凝膠理化性質(zhì)的影響,分別以液態(tài)形式(已配制成凝膠)和固態(tài)形式(粉末)對海藻酸鈉進行高壓蒸汽滅菌,固態(tài)滅菌的粉末進一步在無菌條件下配成凝膠,用于細胞實驗。
1.3 小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(mMSCs)的分離、培養(yǎng)和純化 取出生7 d的ICR雄性小鼠兩側(cè)股骨,剔除肌肉等其他組織,用D-Hanks液將細胞從骨髓腔中吹打出,經(jīng)離心后加入至含有15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,按3×106/cm2接種于6 cm的培養(yǎng)皿中。置于37℃的5%CO2飽和濕度為95%的CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。2 d后全量換液,以后每2~3 d更換一次培養(yǎng)基。細胞融合達80%時用0.25%胰蛋白酶消化2~3 min,用全培養(yǎng)液終止消化,1000 r/min離心5 min,棄上清后用全培養(yǎng)液重新懸浮細胞。每皿細胞重新接種到2個培養(yǎng)皿內(nèi),進行傳代擴增純化。
1.4 MTT法測定細胞活性 分別用固態(tài)滅菌和液態(tài)滅菌兩種方法,各配制濃度為1%和5%及10%的海藻酸鈉凝膠鋪于96孔板底。取第3代對數(shù)生長期的mMSCs,制備單細胞懸液,按750個細胞/孔接種于鋪有海藻酸鈉凝膠并含完全培養(yǎng)液的96孔培養(yǎng)板中。6 d內(nèi)每天進行MTT試驗。每孔細胞加入10 μl MTT(1 g/L),繼續(xù)培養(yǎng)4 h。離心去除培養(yǎng)液,加入二甲亞砜裂解細胞,570 nm波長下測定OD值。以未加MTT孔為本底,其余孔的OD值扣除本底后均以該組未鋪凝膠孔為基準換算成百分數(shù)。
1.5 動物及SCI模型 雄性ICR小鼠18只(購自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院),體重(20±2)g。動物隨機分成3組:移植組(SA-mMSCs組,n=6),手術(shù)對照組(control組,n=6)以及假手術(shù)組(sham組,n=6)。SCI模型采用脊髓全橫斷方法制備。小鼠麻醉后手術(shù),打開椎板暴露T9-T10節(jié)段脊髓,在T9-T10脊髓節(jié)段之間切除一段脊髓,建立脊髓全橫斷損傷模型。移植組術(shù)后于椎管內(nèi)填充等劑量包裹有mMSCs的海藻酸鈉凝膠;手術(shù)對照組術(shù)后不填充任何物質(zhì);假手術(shù)組僅打開椎板,不切斷脊髓。手術(shù)后給予定期排尿,每日1次腹腔注射青霉素抗感染。
1.6 行為學(xué)評分 實驗小鼠分別在術(shù)后1、3、6、10、14 d進行行為學(xué)評分,采用Basso小鼠后肢運動功能評分法(Basso mouse scale,BMS)評價小鼠脊髓神經(jīng)功能恢復(fù)情況。將小鼠放在曠場上,5 min內(nèi)觀察其爬行時臀、膝、踝關(guān)節(jié)、行走、軀干運動及其協(xié)調(diào)情況。評分在雙盲條件下進行。
1.7 組織切片觀察 實驗動物于術(shù)后14 d處死,經(jīng)灌注固定后取出脊髓組織,分別經(jīng)固定及蔗糖梯度脫水后,行冰凍連續(xù)縱切片,片厚20 μm。脊髓組織切片用抗神經(jīng)絲(NF-200)進行免疫熒光染色,結(jié)果在熒光顯微鏡(尼康ECLIPSE 50i)下觀察。每張切片在鏡下(×200)隨機選取5個不同的視野拍照,采用自帶圖像分析軟件,計數(shù)每個視野中全部的陽性細胞個數(shù)取平均值。
2.1 海藻酸鈉凝膠的制備 比較兩種溶劑配制的濃度分別為1%和5%及10%的海藻酸鈉凝膠的溶解度,發(fā)現(xiàn)隨著濃度增高,兩組凝膠的溶解度均下降,不同程度出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象;去離子水配制的海藻酸鈉凝膠,在各個濃度均較生理鹽水配制的凝膠有更好的溶解度,故選用去離子水作為本研究中海藻酸鈉的制備溶劑。
2.2 不同滅菌方法制備的海藻酸鈉凝膠對mMSCs活性的影響 分別將mMSCs培養(yǎng)于用液態(tài)滅菌和固態(tài)滅菌方法制備的海藻酸鈉凝膠上,連續(xù)6 d用MTT法測定細胞活性。各時間點的細胞活性分別以未加海藻酸鈉凝膠孔為基準換算成百分數(shù)。與液態(tài)滅菌法相比,固態(tài)滅菌法配置的海藻酸鈉可以顯著提高mMSCs的細胞活性(P<0.01),這種促進作用在培養(yǎng)第4天達到最大(P<0.01)。而兩種方法配置的不同濃度的海藻酸鈉中,10%濃度均為最佳效應(yīng)濃度(表1)。
2.3 海藻酸鈉凝膠包被mMSCs移植對SCI小鼠行為學(xué)評分的影響 在小鼠脊髓全橫斷模型中,用固體滅菌法配置的濃度為10%的海藻酸鈉包被mMSCs填充斷端,該組小鼠從術(shù)后第6天起,2周內(nèi)的BMS評分均高于斷端未填充任何物質(zhì)的手術(shù)對照組(表2)。
表1 不同滅菌方法制備的海藻酸鈉凝膠對mMSCs活性的影響Table 1 The effect of sodium alginate gels prepared with different sterilization on the cell viability of mMSCs(n=10,)
表1 不同滅菌方法制備的海藻酸鈉凝膠對mMSCs活性的影響Table 1 The effect of sodium alginate gels prepared with different sterilization on the cell viability of mMSCs(n=10,)
與無 SA 組比較,*:P <0.05,**:P <0.01;與液態(tài)滅菌法處理比較,#:P <0.05,##:P <0.01.
固態(tài)滅菌法液態(tài)滅菌法時間點 無SA 1%SA 5%SA 10%SA 1 d 100.00 91.18 ±4.91 94.39 ±8.71 97.86 ±6.52 91 %SA 5%SA 10%SA 4.31 ±14.25 96.75 ±9.5 96.75 ±3.752 d 100.00 99.69 ±6.92 103.07 ±4.88 121.17 ±13.88*# 98.00 ±2.01 101.57 ±5.58 103.60 ±3.22*3 d 100.00 101.19 ±10.51 112.20 ±15.78 113.39 ±9.23* 98.00 ±3.55 100.97 ±2.18 105.13 ±2.38*4 d 100.00 224.37 ±17.62**274.79 ±11.65** 289.08 ±11.83**##97.86 ±12.12 104.55 ±13.65 105.80 ±9.015 d 100.00 185.61 ±16.52* 161.36 ±16.82* 256.82 ±10.40**##109.24 ±14.12 124.42 ±16.47* 165.55 ±14.71**6 d 100.00 96.00 ±3.74 100.86 ±3.42 104.31 ±5.00 96.00 ±11.39 101.09 ±17.48 100.61 ±14.56
表2 不同時間點各組小鼠BMS評分比較Table 2BMS score at different time points after SCI(n=6,)
表2 不同時間點各組小鼠BMS評分比較Table 2BMS score at different time points after SCI(n=6,)
與空白對照組比較,*:P<0.05.
組別1 d 3 d 6 d 10 d 14 d空白對照 0.33 ±0.16 2.53 ±0.22 3.20 ±0.30 4.73 ±0.27 5.93 ±0.19 SA-mMSCs 0.37 ±0.12 3.27 ±0.54 4.20 ±0.42* 5.34 ±0.17* 7.33 ±0.38*假手術(shù) 8.12 ±0.37 8.20 ±0.43 8.27 ±0.22 8.23 ±0.35 8.24 ±0.25
2.4 免疫熒光染色結(jié)果 假手術(shù)組小鼠脊髓縱切片的灰質(zhì)部NF-200陽性細胞明顯多于其余2組,且細胞有較多突起,結(jié)構(gòu)有序。手術(shù)對照組的斷端附近結(jié)構(gòu)紊亂,灰質(zhì)部NF陽性細胞減少,細胞形態(tài)異常。而SA-mMSCs組小鼠脊髓縱切片的NF陽性細胞明顯多于手術(shù)對照組(P<0.01),且組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)也較對照組有明顯改善(圖1)。
海藻酸鈉是一類從褐藻中提取出的天然線性多糖,由β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古洛糖醛酸(G)通過1,4-糖苷鍵結(jié)合而成。海藻酸鈉較難溶于水,其粉末遇水變濕形成微粒,微粒迅速粘合在一起形成團塊,后者緩慢水化并溶解。當水中含有其它影響海藻酸鹽水合的化合物時,如水中的糖、淀粉或蛋白質(zhì)及濃度高于0.5%的單價陽離子鹽,海藻酸鈉會更難溶解于水,故在配制溶液時需要延長混合時間。本實驗比較了去離子水和生理鹽水兩種溶劑配制的海藻酸鈉凝膠的溶解性,發(fā)現(xiàn)生理鹽水單價陽離子的存在的確增加了海藻酸鈉溶解的難度,當濃度達到10%時出現(xiàn)沉淀。故本實驗選用去離子水作為海藻酸鈉的溶劑。
海藻酸鈉自身帶有二價陰離子,在二價陽離子存在條件下可交聯(lián)形成網(wǎng)狀水凝膠。該凝膠為細胞的生長提供了三維空間,又因其具有很好的親水性,營養(yǎng)物質(zhì)易于滲透擴散,且其酶解產(chǎn)物對細胞無毒害作用,故非常適宜細胞生長。因此,海藻酸鈉凝膠在組織工程研究中日益受到重視[4]。用于組織工程的材料在使用前都需要進行滅菌處理,而海藻酸鈉是一種對熱敏感的多糖單鏈大分子,在溶液狀態(tài)下,加熱和照射都會導(dǎo)致分子鏈斷裂,以至于影響海藻酸鈉的理化性能[8]。李洪川等研究了不同的消毒方法對海藻酸鈉-明膠共混體的pH值、吸光度值和黏度的影響,發(fā)現(xiàn)固體高壓蒸汽滅菌法的影響相對較小,是較好的滅菌方法[9]。本實驗在其研究基礎(chǔ)上,比較了液態(tài)高壓蒸汽滅菌法和固態(tài)高壓滅菌法制備的海藻酸鈉凝膠的pH值及其對MSCs的生物學(xué)性狀的不同影響。
圖1 術(shù)后2周各組小鼠脊髓組織NF-200陽性細胞的比較Fig.1 Positive staining of NF-200 in spinal cord tissues 2 weeks after SCI
海藻酸鈉作為組織工程的載體,使細胞的生活狀態(tài)接近體內(nèi)狀態(tài),有利于細胞內(nèi)環(huán)境的維持[10-11]。王嫣等觀察了海藻酸鈉對大鼠MSCs的生物學(xué)效應(yīng),發(fā)現(xiàn)MSCs在海藻酸鈉凝膠中生長良好,且向成骨細胞分化[5]。王海寶等將海藻酸鈉作為許旺細胞移植的載體用于脊髓損傷的治療,觀察到許旺細胞-海藻酸鈉凝膠移植能抑制大鼠脊髓損傷后脊髓細胞凋亡、促進Bcl-2的表達,促進脊髓運動功能的恢復(fù)[7]。為明確海藻酸鈉凝膠對mMSCs的生物學(xué)效應(yīng),我們用兩種不同滅菌方法制備了1%、5%、10%三種濃度的海藻酸鈉凝膠,分別用作mMSCs的載體,以MTT法鑒定不同時間點細胞活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),固態(tài)高壓蒸汽滅菌法制備的海藻酸鈉凝膠pH值為7.21,與小鼠生理條件最為接近;同時,該法制備的凝膠可提高mMSCs的活性,且以濃度為10%最為明顯。故我們選擇用固態(tài)滅菌法制備的濃度為10%的海藻酸鈉凝膠作為mMSCs移植的載體,用于脊髓全橫斷模型的干細胞移植治療。
干細胞移植被認為是脊髓損傷修復(fù)最有前景的治療手段[12],研究發(fā)現(xiàn)SCI后移植MSCs,后者可通過抑制免疫反應(yīng),分化為神經(jīng)樣細胞,或分泌神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì),促進損傷脊髓修復(fù)和神經(jīng)功能恢復(fù)。但是干細胞移植過程中常需要合適的載體?;诤T逅徕c凝膠良好的生物相容性,較大的細胞載入量及我們觀察到的提高活性作用,我們用固態(tài)滅菌法配制濃度為10%的海藻酸鈉凝膠包被mMSCs,填充小鼠脊髓斷端,2周內(nèi)評價小鼠后肢的運動功能,并在組織切片上觀察神經(jīng)絲的表達情況。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與未進行移植治療的SCI組小鼠比,海藻酸鈉-mMSCs移植組小鼠的后肢運動功能明顯增強,與之對應(yīng),其脊髓切片NF-200陽性細胞明顯較未移植組多,且組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)有較顯著的改善。這些結(jié)果提示,用固態(tài)滅菌法制備的海藻酸鈉凝膠包被mMSCs不僅能在體外促進細胞活性,還能在體內(nèi)改善mMSCs的生存環(huán)境,從而促進損傷段神經(jīng)的再生,加速脊髓損傷的修復(fù)過程。
綜上所述,我們分別在細胞水平和動物模型整體水平上,探討了不同方法制備的海藻酸鈉凝膠對mMSCs的生物學(xué)性狀的影響及其臨床應(yīng)用價值,結(jié)果表明,用固態(tài)高壓蒸汽滅菌法制備的海藻酸鈉凝膠能在體外促進mMSCs的活性,將其作為干細胞的移植載體在小鼠脊髓損傷治療中有較好的療效,為臨床干細胞移植治療中細胞載體的選擇提供了實驗參考。
[1]CAI Pei-qiang,TANG Xun,LIN Yue-qiu(蔡培強,湯 遜,林月秋).Present situation and progress in research on transplantation and repair of spinal cord injuries[J].Chinese Journal of Trauma(中華創(chuàng)傷雜志),2004,20(11):701-707.(in Chinese)
[2]UCCELLI A,BENVENUTO F,LARONI A,et al.Neuroprotective features of mesenchymal stem cells[J].Best Pract Res Clin Haematol,2011,24(1):59-64.
[3]CHEN Shao-qiang,LIN Jian-hua(陳少強,林建華).Advances in Repair of Spinal Cord Injury by Transplantation 0f Marrow Mesenchymal Stem Cells[J].Chinese JournalofReparative and Reconstructive Surgery(中國修復(fù)重建外科雜志),2007,21(5):507-514.(in Chinese)
[4]HE Shu-lan,YIN Yu-ji,ZHANG Min,et al(何淑蘭,尹玉姬,張 敏,等).Research Advances on Sodium Alginate Hydrogels for Tissue Engineering[J].ChemicalIndustry and Engineering Progress(化工進展),2004,11(23):1174-1178.(in Chinese)
[5]WANG Yan,CHEN Xiao-ju,WANG Lan,et al(王嫣,陳小菊,王 蘭,等).The Effects of Alginate Gels on Bone Mesenchymal Stem Cells[J].Journal of Chongqing Medical University(重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報),2006,31(4):478-536.(in Chinese)
[6]WANG Yan,CHEN Xiao-ju,WANG Lan,et al(王嫣,陳小菊,王 蘭,等).Induction of Bone Mesenchymal Stem Cells to Form Osteoblast on Alginate Gels[J].China Biotechnology(中國生物工程雜志),2006,26(9):38-42.(in Chinese)
[7]WANG Hai-bao,MA Xue-qian,LIU Zeng-Xu,et al(王海寶,馬學(xué)強,劉曾旭,等).Schwann cellsalginic acid sodium hydrogel transplantation for repair of spinal cord injury in rats[J].J ournal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research(中國組織工程研究與臨床康復(fù)),2009,13(38):7539-7542.(in Chinese)
[8]LI Bo,DOU Ming,YANG Hong-xia(李 博,竇明,楊紅霞).Study on Heat Stabilization of Sodium Alginate[J].Journal Of Anhui Agricultural Sciences(安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)),2009,37(35):17348-17375.(in Chinese)
[9]LI Hong-chuan,YUAN Xiao-ming,XIA Yang,et al(李洪川,袁曉明,夏 揚,等).Effect of Different Sterilization on Sodium Polymannuronate-Gelatin Complex[J].Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research(中國組織工程研究與臨床康復(fù)),2009,13(3):510-512.(in Chinese)
[10]YU J,CHRISTMAN K L,CHIN E,etal.Restoration ofLeftVentricularGeometry and Improvement of Left Ventricular Function in a Rodent Model of Chronic Ischemic Cardiomyopathy[J].J Thorac Cardiovasc Surg,2009,137(1):180-186.
[11]YU J,GU Y P,DU K T,et al.The Effect of Injected RGD Modified Alginate on Angiogenesis and Left Ventricular Function in a Chronic Rat InfarctModel[J].Biomaterials,2009,30:751-756.
[12]WRIGHT K T,EL MASRI W,OSMAN A,et al.Bone Marrow for the Treatment of Spinal Cord Injury:Mechanisms and Clinical Application[J].Stem Cells,2010,29(2):169-178.