蔣立娣，宣貴達(dá)，趙 嵐，朱炎斐，樓雪芳

(浙江大學(xué)城市學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310015)

桑葉作為傳統(tǒng)的中藥材之一，具有藥性平和、無(wú)毒副作用等特點(diǎn)，已經(jīng)被國(guó)家衛(wèi)生部正式歸入“藥食同源”之列，引起眾多研究者的關(guān)注。黃酮類(lèi)化合物是桑葉中主要的藥理活性成分之一，它們含有多個(gè)羥基，主要以與葡萄糖、鼠李糖等結(jié)合成為糖苷的形式存在。研究表明，絕大多數(shù)黃酮苷類(lèi)化合物口服后，首先在腸道微生物或/及小腸上皮細(xì)胞水解酶作用下，轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的黃酮苷元而被吸收，因此，口服黃酮苷類(lèi)化合物的效應(yīng)成分多為其苷元［1-3］。綜觀文獻(xiàn)，許多對(duì)桑葉黃酮類(lèi)化合物的研究往往集中在含量測(cè)定和藥理學(xué)研究方面，如抗炎、抗氧化、降血糖、降血脂等［4-6］，而對(duì)其在生物體內(nèi)的含量測(cè)定和吸收情況的研究未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，相關(guān)的研究是銀杏類(lèi)藥物中黃酮的體內(nèi)含量測(cè)定和生物利用度比較［7-8］。因此，為了探究桑葉提取物效應(yīng)成分在體內(nèi)的吸收和代謝情況，為桑葉類(lèi)藥物的臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究提供一定的參考，建立大鼠血漿中槲皮素、山萘酚和異鼠李素的測(cè)定方法很有積極意義。在本研究中，我們建立了同時(shí)測(cè)定大鼠血漿中槲皮素、山萘酚和異鼠李素的高效液相色譜法，并以建立的方法考察了大鼠口服桑葉提取物后各主要代謝產(chǎn)物濃度隨時(shí)間的變化，以DAS藥動(dòng)學(xué)軟件計(jì)算了統(tǒng)計(jì)矩參數(shù)。

1 材料和方法

1.1 儀器與試藥 Agilent1100高效液相色譜儀，DAD檢測(cè)器，四元泵，Agilent1100 Chemstation(Agilent公司)。

槲皮素和山萘酚對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)，異鼠李素和木犀草素對(duì)照品(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，HPLC級(jí)，含量≥98%);桑葉提取物(浙江大學(xué)藥學(xué)院藥物研究所提供);甲醇為國(guó)產(chǎn)色譜純，其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠，5只，雄性，180～230 g，清潔級(jí)，浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.3 色譜條件 色譜柱:Agilent Zorbax SB-C18色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇∶0.2% 磷酸 =50∶50(v/v)，流速:1.0 ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng):380 nm;柱溫:37℃;進(jìn)樣量:75 μl;內(nèi)標(biāo)法定量。

1.4 大鼠血樣的采集 大鼠于實(shí)驗(yàn)前15 h禁食(自由飲水)，后尾靜脈采血0.25 ml作為空白血漿，接著灌胃給藥 FME(110 mg/kg)的0.5%CMC-Na混懸液。在分別給藥后的0.0833、0.333、0.667、1.00、1.50、2.00、3.00、4.00、6.00、8.00、12.0、24.0、48.0、72.0、96.0、120 h，從尾靜脈取血約0.25 ml，置于肝素化的離心管中，10000 r/min離心5 min，分離血漿，－20℃冰箱中保存，備用。

1.5 血漿樣品預(yù)處理 精密移取血漿0.1 ml置10 ml離心管中，精密加入9.996 μg/ml的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)木犀草素9.0 μl，漩渦混勻1 min，然后漩渦并緩慢加入濃度為3 mol/L HCl 0.2 ml，90℃水浴中水解1 h，冰浴冷卻，冷卻后精密加入乙醚-丙酮(14∶1)混合液3.0 ml，漩渦提取5 min，4000 r/min離心10 min，完全移取上清液揮干，殘?jiān)尤肓鲃?dòng)相150 μl，漩渦溶解1 min，13000 r/min 離心 10 min，取上清液 75 μl，HPLC進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果

2.1 方法選擇性 通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相比例，當(dāng)甲醇∶0.2%的磷酸為50∶50(v/v)時(shí)槲皮素、木犀草素、山萘酚和異鼠李素均達(dá)到基線分離?？瞻籽獫{、空白血漿+對(duì)照品以及給藥后血漿樣品的HPLC圖譜見(jiàn)圖1。由圖可知，空白血漿在槲皮素、木犀草素、山萘酚和異鼠李素保留時(shí)間處均無(wú)干擾峰，說(shuō)明血漿內(nèi)源性物質(zhì)不影響本實(shí)驗(yàn)的測(cè)定，即本方法具有較好的選擇性。

圖1 大鼠血漿HPLC圖譜Fig.1 Representative HPLC chromatograms of rat plasma

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下限 精密移取對(duì)照品溶液適量于離心管中，以空白血漿配成含槲皮素、山萘酚和異鼠李素的濃度分別在0.0545～8.73 μg/ml、0.0954 ～ 14.7 μg/ml、0.0545 ～8.55 μg/ml間的7個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿質(zhì)控樣品，每一濃度3份，按“1.5”項(xiàng)下操作。以藥物與木犀草素峰面積的比值為縱坐標(biāo)(Y)，藥物濃度為橫坐標(biāo)(X)，進(jìn)行線性回歸，獲得槲皮素、山萘酚和異鼠李素的回歸方程分別為:y1=0.3724x1+0.157(r=0.9979);y2=0.568x2－0.0444(r=0.9993);y3=0.4042x3－0.0179(r=0.9981)。表明槲皮素在0.0545～8.73 μg/ml，山萘酚在 0.0954 ～14.7 μg/ml，異鼠李素在0.0545～8.55 μg/ml范圍內(nèi)線性良好。槲皮素、山萘酚和異鼠李素的定量下限(LOQ)分別為 0.0545、0.0954和 0.0545 μg/ml。

2.3 回收率 精密移取對(duì)照品溶液適量于離心管中，以空白血漿配成含槲皮素、山萘酚及異鼠李素的濃度為(0.148，0.260，0.148)、(3.04，5.34，2.85)、(6.53，11.0，6.56)μg/ml的質(zhì)控樣品，每一質(zhì)量濃度制備5份樣品，按“1.5”項(xiàng)下操作。以槲皮素、山萘酚、異鼠李素及內(nèi)標(biāo)與相同藥物濃度條件下純?nèi)軇悠穼?duì)照樣本進(jìn)樣后得到的峰面積進(jìn)行比較，計(jì)算提取回收率;以槲皮素、山萘酚和異鼠李素與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值代入隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線求得各質(zhì)量濃度測(cè)定值，與加入量比較計(jì)算方法回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

結(jié)果表明，高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度下槲皮素和山萘酚的絕對(duì)回收率均高于79.4%，但低濃度下異鼠李素的絕對(duì)回收率為62.8%，偏低;三者的方法回收率均在94.7% ～107% 。

2.4 方法精密度 精密移取對(duì)照品溶液適量于離心管中，以空白血漿配成含槲皮素、山萘酚及異鼠李素的濃度為(0.148，0.260，0.148)、(3.04，5.34，2.85)、(6.53，11.0，6.56)μg/ml的質(zhì)控樣品，每一質(zhì)量濃度制備5份樣品，按“1.5”項(xiàng)下操作，記錄槲皮素、山萘酚及異鼠李素與木犀草素的峰面積比值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線求得各質(zhì)控樣品的濃度值。計(jì)算日內(nèi)精密度RSD和5 d內(nèi)的日間精密度RSD，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 槲皮素、山萘酚和異鼠李素的回收率Table 1 Recoveries of extraction and assay for quercetin，kaempferol and isorhamnetin(n=5)

表2 槲皮素、山萘酚和異鼠李素的方法精密度Table 2 Presicion of assay for quercetin，kaempferol and isorhamnetin(n=5)

從表2中可知，槲皮素、山萘酚及異鼠李素的日內(nèi)和日間精密度RSD分別小于9.5%和9.8%，表明該方法準(zhǔn)確、精密，重復(fù)性較好。

2.5 樣品穩(wěn)定性 精密移取對(duì)照品溶液適量于離心管中，以空白血漿配制高、低濃度的質(zhì)控樣品，其中槲皮素(0.300，6.53)μg/ml、山萘酚(0.525，11.0)μg/ml、異鼠李素(0.300，6.56)μg/ml。每一質(zhì)量濃度3份樣品，按“1.5”項(xiàng)下操作，分別于室溫 0、4、8 h 及 －20℃ 3、7、15 h以及解凍凍融1、2、3次后測(cè)定，記錄槲皮素、山萘酚和異鼠李素與木犀草素的峰面積的比值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線求得各質(zhì)控樣品的濃度值，并與同濃度0 h質(zhì)控樣品比較后計(jì)算回收率。

結(jié)果表明，樣品在－20℃冷凍15 d后三者含量均在90.4% ～103%內(nèi)，穩(wěn)定性良好。而在室溫條件下，山萘酚穩(wěn)定性良好，8 h后，高低濃度下的回收率分別為75.8%和80.8%;異鼠李素的穩(wěn)定性不及山萘酚，8 h后，高濃度下的回收率僅為60.0%;槲皮素的穩(wěn)定性明顯欠缺，8 h后，高低濃度下的回收率均低于50%，提示樣品不宜在室溫條件下長(zhǎng)時(shí)間置放。結(jié)果也表明，經(jīng)過(guò)2次凍融解凍過(guò)程后，待測(cè)成分各濃度均在初始濃度的85.5% ～96.7%內(nèi)，但經(jīng)過(guò)3次凍融，槲皮素高低濃度下、異鼠李素低濃度下的濃度降低較多，僅為初始濃度的74.6%～77.4%，提示實(shí)際測(cè)定時(shí)樣品最多進(jìn)行2次凍融。

2.6 大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué) 大鼠灌胃給藥FME(110 mg/kg)，收集給藥前及給藥后0.0833、0.333、0.667、1.00、1.50、2.00、4.00、6.00、8.00、12.0、24.0、48.0、72.0、96.0、120 h 時(shí)間點(diǎn)血漿。通過(guò)建立的HPLC方法，測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)血漿中槲皮素、山萘酚及異鼠李素的總濃度，利用DAS軟件，計(jì)算統(tǒng)計(jì)矩參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表3和圖2。

表3 大鼠口服桑葉提取物后血漿中槲皮素、山萘酚及異鼠李素的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Table 3 Pharmacokinetic parameters of quercetin，kaempferol and isorhamnetin in rat plasma after oral administration of FME(n=5)

由圖2可見(jiàn)，大鼠灌胃給藥(110 mg/kg)FME后槲皮素、山萘酚及異鼠李素迅速達(dá)到一個(gè)峰濃度，6 h左右，山萘酚和異鼠李素第二次達(dá)到峰濃度;同時(shí)，由表3可知，三者的T1/2z分別為 92.7，67.9 和54.2 h。這提示三者在大鼠體內(nèi)分布非常迅速，而滯留非常久長(zhǎng)。

3 討論

考慮到槲皮素、其它的黃酮類(lèi)或異黃酮在血漿和尿液中多以甲基化/葡糖醛酸化/硫酸化的結(jié)合物形式存在，大鼠血漿中槲皮素、山萘酚及異鼠李素很可能是以游離和結(jié)合兩種形式并存。因此，本研究將給藥后血漿水解再進(jìn)行測(cè)定，使三者的葡萄糖醛酸、硫酸酯以及其他結(jié)合物均能水解成游離的單體，進(jìn)而測(cè)定各代謝產(chǎn)物的總濃度。研究用單因素考察的方法考察了鹽酸濃度、水浴溫度和水解時(shí)間對(duì)水解結(jié)果的影響，結(jié)果表明，鹽酸濃度為3 mol/L，水浴溫度為90℃，水解時(shí)間為60 min時(shí)，各代謝產(chǎn)物的提取效率較為理想。

圖2 大鼠口服FME(110 mg/kg)后的平均血漿藥物濃度-時(shí)間曲線Fig.2 The plasma concentration-time curve of quercetin，kaempferol and isorham-netin in rats after oral administration of FME(110 mg/kg).Data are expressed as mean±SD(n=5)

在內(nèi)標(biāo)的選擇中，我們?cè)捎们鄄怂?，但芹菜素出峰時(shí)間較晚。后考慮到木犀草素結(jié)構(gòu)與被測(cè)物相似，根據(jù)文獻(xiàn)［9］，其油水分配系數(shù)(1ogP)為 2.30，介于槲皮素(2.10)和山萘酚(2.50)之間，分析其保留時(shí)間可能也在兩者之間，且我們?cè)谧錾Ｈ~提取物水解槲皮素和山萘酚含量測(cè)定［10］時(shí)，在本研究流動(dòng)相條件下，并未檢測(cè)出木犀草素。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，木犀草素的保留時(shí)間恰好落在槲皮素和山萘酚之間，槲皮素、山萘酚、異鼠李素和木犀草素的絕對(duì)回收率相差接近10%，符合內(nèi)標(biāo)法測(cè)定的要求。

本研究中，藥動(dòng)學(xué)結(jié)果提示，槲皮素、山萘酚和異鼠李素在大鼠體內(nèi)的分布迅速，而滯留久長(zhǎng)。研究同時(shí)顯示，山萘酚和異鼠李素出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，這和文獻(xiàn)報(bào)道一致，可能是存在肝腸循環(huán)，引起血漿濃度的再次集結(jié)。結(jié)果也提示，大鼠口服的劑量可能偏高，致使各代謝產(chǎn)物的終末相半衰期遠(yuǎn)大于文獻(xiàn)報(bào)道。同時(shí)我們也認(rèn)為，本研究的藥物為桑葉提取物，組成成分之間的相互作用可能會(huì)使吸收、分布、代謝等轉(zhuǎn)運(yùn)環(huán)節(jié)發(fā)生變化，也有可能其中的其它成分在體內(nèi)的代謝與效應(yīng)成分的代謝一致，致使循環(huán)吸收和消除相半衰期延長(zhǎng)。但桑葉是一種無(wú)毒副作用的傳統(tǒng)中藥材，血漿中長(zhǎng)時(shí)間較高的藥物濃度，更有利于其生物利用度的提高和藥效作用。

［1］CHOOI Y L，HWEE M C，SI M S.Mulberry leaves protectrattissues from immobilization stressinduced inflammation ［J］.BioFactors，2007，31:25-33.

［2］THOMAS W.Absorption and metabolism of flavonoids［J］.Free RadicalBiology and Medicine，2004，36(7):830-831.

［3］KIM D H，KIM S Y，PARK S Y.Metabolism of quercetin by human intestinal bacteria and its relation to some biological activity ［J］.Biological＆PharmaceuticalBulletin，1999，22(7):749-751.

［4］JIANG Yu-lan，PIAO Hui-shan，LI Gao(姜玉蘭 ，樸惠善，李 鎬).Study on antioxidant activity of constituents from mulberry leaf［J］.Journal of Chinese Medicinal Materials(中藥材)，2008，31(4):519-522.(in Chinese)

［5］ZHU Yu-xia，ZOU De-ping，LIU Xue-peng，et al .(朱玉霞，鄒德平，劉學(xué)鵬，等).Effects of mulberry leaves flavonoids on insulin resistance in type 2 diabetic rat［J］.Sichuan Medical Journal(四川醫(yī)學(xué))，2008，29(9):1114-1116.(in Chinese)

［6］XIE Hui-ping，LIU Yi-nong，GUO Ming(謝惠萍，劉以農(nóng)，郭 明).Experimental study of the mulberry leaf extracts's effect on blood lipids［J］.Modern Medicine Journal of China(中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)藥雜志)，2006，8(11):48-49.(in Chinese)

［7］CHEN Z P，SUN J，CHEN J.Comparative pharmacokinetics and bioavailability studies of quercetin，kaempferol and isorhamnetin after oral administration of Ginkgo biloba extracts，Ginkgo biloba extract phospholipid complexes and Ginkgo biloba extractsolid dispersionsin rats ［J］.Fitoterapia，2010，81:1045-1052.

［8］HUANG Min-wen，WANG Guang-ji，LI Hao，et al(黃敏文，王廣基，李 昊，等).Simultaneous determination of quercetin，kaempferol and isorhamnetin in dog plasma by HPLC-MS/MS，［J］.Chinese Journal Clinical Pharmacology Therapeutics(中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué))，2008，13:1330-1339.(in Chinese)

［9］XIA Man-li，GAO Qin，ZHOU Xin-mei，et al(夏滿(mǎn)莉，高 琴，周新妹，等).Vascular effect of extract from mulberry leaves and underlying mechanism［J］.Journal of Zhejiang University:Medical Sciences(浙江大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版)，2007，36(1):48-53.(in Chinese)

［10］JIANG Li-di.，XUAN Gui-da，WU Hao-hao(蔣立娣，宣貴達(dá)，吳好好)Determination of quercetin and kaempferolin Folium MoriExtractafter hydrolysis by hydrochloric acid ［J］.Journal of Zhejiang University:Science Edition(浙江大學(xué)學(xué)報(bào):理學(xué)版)，2009，36(1):704-707.(in Chinese)