施育平，龔化蘭，劉海波，單 江，徐 耕，王建安

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科，浙江 杭州 310009)

凝血栓蛋白-1(Thrombospondin-1，TSP-1)又稱血小板反應(yīng)素-1，為一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，大量存在于血小板顆粒和細(xì)胞外基質(zhì)中?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，多種細(xì)胞包括激活的血小板、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞等都可以合成并分泌TSP-1，其與一系列因子相互作用，調(diào)控血小板粘附和聚集、血管平滑肌細(xì)胞增殖等細(xì)胞功能［1］。TSP-1基因第l3外顯子編碼鈣結(jié)合域存在N700S單核苷酸多態(tài)性(Single Ncleotide Polymorphisms，SNP)A8831G，即其編碼的第 700位氨基酸-絲氨酸被天冬氨酸替代，可以形成AA、AG及GG三種不同的基因表型。Topol等［2］對(duì) 352 例冠心病(coronary artery disease，CAD)患者，其中急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)190例和 418例對(duì)照者的GeneQuest研究發(fā)現(xiàn)，攜帶700S等位基因早發(fā)AMI的危險(xiǎn)性是正常人的9倍，可以用來預(yù)測AMI發(fā)生。隨后意大利學(xué)者［3］的研究重復(fù)了以上研究結(jié)果，但荷蘭［4］、日本［5］等相關(guān)研究均未證實(shí)以上結(jié)果。這提示該基因多態(tài)性與冠心病相關(guān)可能與種族和地區(qū)有關(guān)。因此，我們以2005年3月至2007年3月我院住院行冠狀動(dòng)脈造影患者為研究對(duì)象，采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)行TSP-1單核苷酸多態(tài)性研究，探討其與中國浙江地區(qū)漢族人群冠心病的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象 ①CAD組:為178例冠心病患者，其中男110例，女68例，平均年齡(61.8±10.3)歲，均選自2005年3月至2007年3月因胸痛入住浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科的住院患者，經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影檢查，以冠狀動(dòng)脈主要分支左前降支(LAD)、左回旋支(LCX)、右冠狀動(dòng)脈(RCA)中任何一支血管內(nèi)徑狹窄≥50%為陽性;其中急性心肌梗死者55例，病例均符合2002年AHA/ACC關(guān)于AMI診斷指南的診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］。②Control組:正常對(duì)照組，158例，其中男85例，女73例，平均年齡(59.8±10.8)歲，選自同期因疑似冠心病入住浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科的住院患者，經(jīng)心電圖、運(yùn)動(dòng)平板、心肌酶譜等排除冠心病診斷，所有入選者經(jīng)冠脈造影證實(shí)其主要血管完全正常。

本研究所有受試者均為中國浙江地區(qū)漢族人，個(gè)體之間無血緣關(guān)系。對(duì)照組與冠心病組相比，年齡及性別構(gòu)成差異均無顯著性(P均＞0.05)，排除合并有先天性心臟病、心肌病、心臟瓣膜病;腎臟和肝臟疾病患者;數(shù)月前有手術(shù)和外傷者;惡性腫瘤及發(fā)熱性疾病等;詳細(xì)調(diào)查吸煙史，同時(shí)檢測血壓、血脂和空腹血糖等指標(biāo)。

1.2 DNA提取 所有研究對(duì)象均于手術(shù)當(dāng)天采集靜脈血2 ml，EDTA抗凝，分離血漿和白細(xì)胞，血漿－20℃凍存，白細(xì)胞層采用酚/氯仿法提取基因組DNA。

1.3 TSP-1基因擴(kuò)增、電泳 以提取的基因組DNA為模版，采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增TSP-1基因片段，引物設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)［5］，上游P1為5'-AAG AAC GCC AAG TGC AAC TAC-3';下游P2為5'－AGA GCT AGC CCT GTT CAT GTT-3'，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。擴(kuò)增參數(shù):94℃預(yù)變性5 min→94℃變性60 s→58℃退火60 s→72℃延伸40 s，32個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸8 min。反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物 10 μl經(jīng) 2%瓊脂糖凝膠電泳，90 mV，30 min，凝膠成像分析系統(tǒng)觀察擴(kuò)增結(jié)果，結(jié)合DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)判斷是否為目的片斷，擴(kuò)增產(chǎn)物約為360 bp。

1.4 TSP-1基因擴(kuò)增產(chǎn)物的限制性酶切、電泳酶切反應(yīng)體系20 L，其中按照設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出360 bp 長度的 PCR 產(chǎn)物 10 μl，BseNI內(nèi)切酶 5 U，Bufer B 2 μl，65℃反應(yīng) 16 h。反應(yīng)終止后，酶切產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察酶切結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料以表示，均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)后行t檢驗(yàn);用Hardy-Weinberg平衡確認(rèn)其群體代表性，基因型和等位基因頻率等計(jì)數(shù)資料采用直接計(jì)數(shù)法，組間比較行χ2檢驗(yàn);以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CAD組和正常對(duì)照組一般資料的比較兩組年齡、性別、高血壓患者比例比較差異無顯著性(P＞0.05)。CAD組吸煙發(fā)生率明顯高于正常對(duì)照組，兩者比較差異有顯著性(P＜0.01)。兩組間甘油三酯(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)等血脂比較差異無顯著性，但CAD組患者的高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)明顯低于正常對(duì)照組(P＜0.01)。兩組間空腹血糖值比較差異無顯著性，但糖尿病患者比例明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.01)。兩組間收縮壓比較差異有顯著性，但舒張壓比較差異無顯著性。見表1。

表1 CAD組和正常對(duì)照組臨床和實(shí)驗(yàn)室資料Table 1 The clinical and laboratory date in CAD group and control group

2.2 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) CAD組和正常對(duì)照組的TSP-1基因型分布χ2值分別為0.013和0.002，P值均 ＞0.05，符合 Hardy-Weinberg平衡(表2)。這說明樣本具有群體代表性。

2.3 正常對(duì)照組和CAD組TSP-1基因型及等位基因頻率分布 AA野生型不被BseNI內(nèi)切酶酶切，電泳結(jié)果為360 bp的單一條帶;AG雜合型被酶切成360、250、110 bp三條帶，GG突變型酶切后應(yīng)為250、110 bp兩條帶(圖1、2)。在所有被檢測的336例對(duì)象中，正常對(duì)照組158例，CAD組178例。兩組均以AA型為主，僅檢測出AG雜合型4例，未檢測到一例GG純合子(表3)。兩組中AG雜合型所占比例比較差異無顯著性，AG型和CAD發(fā)病無相關(guān)性(χ2=0.788，P=0.375;AG 對(duì) AA:OR=2.691，95%CI:0.277～26.140)。同時(shí)，兩組 G 堿基頻率比較也無顯著性差異(χ2=0.784，P=0.376)。G等位基因在本研究正常對(duì)照組及CAD組中的頻率分別為0.3%和0.8%。

表2 TSP-1基因型分布頻率及遺傳平衡吻合度檢驗(yàn)Table 2 The distributions of TSP-1 genotypes and Hardy-Weinberg examination

圖1 PCR產(chǎn)物的凝膠電泳Fig.1 Agrose gel electrophoresis of PCR products

圖2 PCR產(chǎn)物的酶切電泳結(jié)果Fig.2 The distributions of TSP-1 polymorphisms

2.4 正常對(duì)照組和AMI組TSP-1基因型及等位基因頻率分布 在所有被檢測的158例正常對(duì)照組及55例AMI組中，兩組均以AA型為主，僅檢測出AG雜合型3例，未檢測到一例GG純合子(表4)。兩組中AG雜合型所占比例比較差異無顯著性(χ2=2.650，P=0.104)。同時(shí)，兩組G等位基因頻率比較差異無顯著性(χ2=0.823，P=0.364)。

表3 CAD組和正常對(duì)照組TSP-1的基因型和基因頻率比較Table 3 The distributions of TSP-1 polymorphisms in CAD group and control group

表4 AMI組和正常對(duì)照組TSP-1的基因型和基因頻率比較Table 4 The distributions of TSP-1 polymorphisms in AMI group and control group

3 討論

TSP-1的編碼基因位于15q15上，由186個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為450 kD，為三條相同肽鏈構(gòu)成同源三聚體蛋白結(jié)構(gòu)。在透射電鏡下，該三聚體的每條單鏈均由球狀氨基末端(NTD)、球狀羧基末端構(gòu)成(CTD)，中間連以細(xì)長，易彎曲的桿狀臂。TSP-1其分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，功能多樣。根據(jù)TSP-1與與其它分子的相互作用?？蓪⒚織l單鏈分成5個(gè)功能區(qū):①末端肝素結(jié)合區(qū)，②與Ⅰ型前膠原區(qū)膠原同源的片段，③與備解素同源含三個(gè)重復(fù)系列的Ⅰ型重復(fù)區(qū)，④與表皮生長因子(EGF)同源含三個(gè)重復(fù)系列的Ⅱ型重復(fù)區(qū)，⑤與鈣調(diào)素同源含七個(gè)結(jié)合Ca2+的Ⅲ型重復(fù)區(qū)。TSP-1其編碼區(qū)A8831G堿基系列的SNP導(dǎo)致其700位氨基酸由天冬氨酸轉(zhuǎn)化為絲氨酸(700N→S)，該堿基系列位于Ⅱ型與Ⅲ型重復(fù)區(qū)(Ca2+-binding site)的交界處［7］。研究發(fā)現(xiàn)，此點(diǎn)的突變可導(dǎo)致 Ca2+結(jié)合率下降［8］。

運(yùn)用TSP SNP重組片段(Ⅲ型重復(fù)區(qū)+N700，Ⅲ型重復(fù)區(qū)+S700，Ⅲ型重復(fù)區(qū)+Ⅱ型重復(fù)區(qū)+N700，Ⅲ型重復(fù)區(qū)+Ⅱ型重復(fù)區(qū)+S700)，添加Ca2+，分析SNP N700S附近一單色氨酸的內(nèi)在瑩光，研究者發(fā)現(xiàn)S700的EC50需要更高的Ca2+濃度。這預(yù)示SNP導(dǎo)致了構(gòu)像改變。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，S700片段的構(gòu)象對(duì)熱變性更敏感:S700達(dá)到Ca2+完全飽和狀態(tài)發(fā)生在50℃，而N700在65℃。這些研究表明，S700 SNP更易于解離Ca2+和熱變性［9］?？傊?，這兩個(gè)研究都表明S700 SNP的構(gòu)象更不穩(wěn)定。可推斷:SNP影響TSP的構(gòu)象從而影響Ca2+親和力。TSP-1蛋白N700S置換導(dǎo)致其鈣結(jié)合域?qū)a2+親和力降低，增加了TSP-1致血小板的聚集和釋放功能，并使斑塊趨向不穩(wěn)定為其引起 AMI的可能機(jī)制［10］。

Topol等［2］于2001年在英國進(jìn)行的GeneQuest研究首先發(fā)現(xiàn)，攜帶700S等位基因早發(fā)AMI的危險(xiǎn)增高9倍，并可以預(yù)測AMI的發(fā)生。同樣，Jeffrey等［11］在意大利的多中心大樣本量的研究也表明，TSP-1基因N700S多態(tài)性與急性心肌梗死的發(fā)生有關(guān)，但2008年Koch教授對(duì)既往該基因多態(tài)性與急性心肌梗死的Meta分析，未提示該基因多態(tài)性與心肌梗死有關(guān)［12］。目前，國內(nèi)關(guān)于TSP-1基因N700S多態(tài)性與冠心病的關(guān)系也有相關(guān)報(bào)道，Lei等［13］的研究表明，TSP-1基因G等位基因的頻率在對(duì)照組及心肌梗死組分別為0.6%及1.7%，G等位基因在心梗組頻率有增加的趨勢，但無顯著性差異。綜上所述，TSP-1基因N700S多態(tài)性與冠心病之間的關(guān)系還存在爭議，因此，需要更多更大量的研究來進(jìn)一步證實(shí)。本研究在中國浙江地區(qū)漢族人中探討TSP-1基因N700S單核苷酸多態(tài)性與冠心病的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在浙江漢族人群中存在TSP-1基因N700S多態(tài)性，G等位基因在正常人群、CAD及AMI組中的頻率分別為 0.3%、0.8%及1.8% ，相對(duì)于西方人群顯著偏低(11%)［12］，但與Lei在中國人群研究中的頻率相似(對(duì)照組與心肌梗死組分別為0.6%及1.7%)。在本研究中G等位基因頻率在CAD及AMI中有增加的趨勢，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，鑒于G等位基因在中國人群中的頻率很低，這可能需要更大樣本量及更進(jìn)一步的研究來驗(yàn)證。

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