廖 勇，敖俊紅，楊蓉婭

? 綜 述 ?

病原真菌外排轉運蛋白與真菌耐藥的研究進展

廖 勇，敖俊紅，楊蓉婭

病原真菌通過對抗機體防御系統(tǒng)和抗真菌藥物的攻擊,從而成功定植于宿主體內并最終導致機體感染, 真菌外排轉運蛋白在上述過程中起著重要作用，主要包括ATP結合盒轉運蛋白（ATP-binding cassette transporters，ABC）與主要易化子超家族（the major facilitator superfamily，MFS），分別通過與ATP水解酶或質子梯度耦合來運輸并清除真菌胞內的毒性物質。與其它生物相比，真菌基因組中具有更多轉運蛋白家族編碼基因，這些轉運蛋白不僅對真菌致病過程中所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物和宿主細胞分泌的抗菌成分起外排作用；同時，在病原真菌對抗臨床抗真菌藥物中也發(fā)揮著重要作用。本文就這兩個超家族的轉運蛋白在主要病原真菌耐藥性中所發(fā)揮的作用進行綜述。

病原真菌；外排轉運蛋白；耐藥；進展

深部真菌病的發(fā)病率在近二十年迅速上升[1]，其中，白念珠菌在所有常見血源性致病真菌中已位列第四。念珠菌屬、隱球菌屬、曲霉菌屬、鐮刀菌屬和接合菌屬等病原真菌均能夠適應機體環(huán)境，且其所引起的深部真菌病均具有較高死亡率。病原真菌不斷受到外源性毒性成分的攻擊，這些化合物可以是其他微生物為爭奪有限生存資源而合成的成分，也可能是機體的防御體系主動合成，或是其他來源的抗真菌物質。不論其來源，這些化合物迫使真菌通過進化來適應周圍環(huán)境并生存下來。對抗這些抗真菌化合物的常見機制就是通過細胞膜表面的外排轉運蛋白將其主動外排，從而減少其在真菌胞內的積聚，使其對于毒性物質產(chǎn)生耐受。研究發(fā)現(xiàn)，這些轉運蛋白是真菌重要的毒力因子，部分轉運蛋白已證實其功能涉及真菌致病性的多個方面，包括鈣鐵攝取，通道運輸，應激耐受和菌相轉換等。本文重點討論ATP結合盒（ABC）轉運蛋白和主要易化子超家族（MFS）與主要病原真菌耐藥的關系。

1 病原真菌外排轉運蛋白的種類及功能

真菌基因組中約每百萬堿基存在10～30個轉運蛋白的編碼基因，比例明顯高于其它生物，對目前已完成測序的真菌基因組研究發(fā)現(xiàn)ABC和MFS為最常見的轉運蛋白超家族，其編碼基因約占真菌基因組所有轉運蛋白編碼基因的50%。盡管ABC和MFS在真菌致病過程中發(fā)揮重要作用，但其編碼基因的數(shù)量與真菌致病性之間未發(fā)現(xiàn)明確相關性，如構巢曲霉和煙曲霉的基因組中都含有45個編碼ABC轉運子的基因，構巢曲霉具有更多的MFS基因，但其致病性遠低于煙曲霉。

ABC轉運蛋白是主要的外排泵轉運蛋白，主要包括ABCA、ABCB、ABCC、ABCD和ABCG五個轉運子家族（其中三個家族ABCB、ABCC和ABCG）與胞內毒性物質的外排密切相關，分別稱為多藥耐藥家族（MDR）、多藥耐藥相關蛋白家族（MRP）以及多效性耐藥家族（PDR）[2]。ABC可通過水解三磷酸腺苷（ATP）供能將物質從細胞內排出。在酵母菌和絲狀真菌中均發(fā)現(xiàn)ABC轉運蛋白中的多效性耐藥家族（PDR）基因存在缺失或多拷貝，表現(xiàn)出較低的進化保守性，表明該家族的成員在外界選擇性壓力下可以迅速發(fā)生適應性反應。MFS轉運蛋白包括17個轉運蛋白家族，其中兩個家族，藥物：H+逆向轉運子（14跨膜片段）（DHA14）和藥物：H+逆向轉運子（12跨膜片段）（DHA12）與外排毒性物質功能相關[3]。

2 外排轉運蛋白與真菌耐藥

病原真菌能夠在抗真菌治療的過程中產(chǎn)生耐藥性，多種因素可以導致病原真菌耐藥性升高，藥物外排轉運蛋白的轉錄增加是其重要因素之一，而相關轉錄激活因子的表達上調在其中起到重要作用[4]。ABC轉運蛋白雖不直接參與真菌的致病過程，但可為具有耐藥性的病原真菌提供“定植”優(yōu)勢。研究發(fā)現(xiàn)白念珠菌的CDR1和CDR2；克柔氏念珠菌的ABC1 和ABC2；光滑念珠菌的CgCDR1、PDH1（也稱為CgCDR2）和SNQ2；煙曲霉的AtrF以及新生隱球菌的CneAFR1和CneMDR1[5-7]與三唑類抗真菌藥物（氟康唑、伊曲康唑、酮康唑、泊沙康唑以及伏立康唑）的單一耐藥或交叉耐藥相關，但與棘白菌素類抗真菌藥物及人組蛋白-5（抗真菌蛋白）的耐藥不相關[8]。白念珠菌的MFS轉運蛋白如MDR1和FLU1 與真菌的耐藥性相關[9]。與ABC轉運蛋白不同， MFS轉運蛋白相對特異地與氟康唑耐藥相關。

2.1 外排轉運蛋白與白念珠菌耐藥

白念珠菌基因組中至少含有27個ABC轉運蛋白，其中7個基因的序列及功能已在白念珠菌基因組數(shù)據(jù)庫（CGD）中得到注釋，包括CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR11、SNQ2和YOR1，并證實或推斷與白念珠耐藥相關[10]。 研究發(fā)現(xiàn)CaCDR1和CaCDR2與抗真菌藥物的外排相關，CaCDR3和CaCDR4編碼磷脂轉移酶，其基因序列與CaCdr1p和CaCdr2p具有高度同源性，但與白念珠菌耐藥不相關[11]。白念珠菌基因組中6個MFS轉運蛋白基因的功能被注釋（MDR1、FLU1、TPO3、f1 9.2350、NAG3和MDR97），CaCdr1p、CaCdr2p和CaMdr1p轉運蛋白是介導白念珠菌對唑類抗真菌藥物耐藥的膜表面外排轉運蛋白。CaMdr1p可特異性引起氟康唑耐藥，但CaCdr1p和CaCdr2p的特異性不強[12,13]。部分白念珠菌氟康唑耐藥株高表達CaCDR1和CaCDR2，而部分耐藥株只高表達CaMDR1[14]，表明唑類耐藥株中至少存在兩個不同的轉錄調控信號途徑調控外排轉運蛋白的表達。盡管白念珠菌氟康唑臨床耐藥是由多機制介導的，但高水平耐藥株與CaCDR1和CaCDR2的高表達更加相關，其中CaCDR1的表達較CaCDR2更為重要[15]。對白念珠菌氟康唑耐藥臨床株轉運蛋白表達量進行研究，結果發(fā)現(xiàn)CaCdr1p的表達量明顯高于CaCdr2p，證明在氟康唑耐藥機制中CaCdr1p起更為重要的作用。因此，CaCdr1p可以作為針對氟康唑耐藥菌株的重要藥物靶點進行進一步研究[16]。

2.2 光滑念珠菌

約30%的光滑念珠菌臨床株對唑類抗真菌藥物表現(xiàn)出中度先天性耐藥。給予唑類抗真菌藥物治療，光滑念珠菌可較快產(chǎn)生對于唑類藥物的獲得性耐藥[17]，且原有治療藥物撤除后，耐藥性仍可穩(wěn)定保存。光滑念珠菌可能存在18個ABC轉運蛋白和15個MFS轉運蛋白[2]。體外試驗研究發(fā)現(xiàn)高表達CgCDR1基因的光滑念珠菌，可引起菌株對唑類藥物耐藥；而該基因的缺陷會導致菌株對唑類藥物敏感性升高。光滑念珠菌ABC轉運蛋白CgSNQ2與釀酒酵母轉運蛋白ScSNQ2具有高度同源性，可介導唑類抗真菌藥物耐藥[7]。光滑念珠菌的CgPDR1和CgPDR3與白念珠菌轉錄因子TAC1是同源基因，可通過與底物結合，促進外排轉運蛋白的表達[18]。光滑念珠菌唑類臨床耐藥株與敏感株相比，CgCDR1和 CgPDH1的表達量顯著升高；且耐藥株的CgPdh1p 存在氨基酸位點替換，導致CgCDR1表達上調及菌株對于唑類藥物的耐藥[19]。

2.3 克柔氏念珠菌

克柔氏念珠菌一般認為對于氟康唑先天性耐藥，但對于新一代唑類抗真菌藥（伏立康唑和泊沙康唑）較為敏感[20]。克柔氏念珠菌對于氟康唑先天耐藥的主要機制是其與藥物靶點Erg11p親和力下降；同時，藥物外排泵的高表達在其中也起重要作用[21]。Katiyar等通過對ABC轉運蛋白NBDs的高度保守區(qū)域設計引物，在克柔氏念珠菌中擴增出兩個ABC轉運蛋白CkABC1和 CkABC2。CkABC2在不同培養(yǎng)條件下均為低水平表達，而CkABC1 可以在不同唑類抗真菌藥的作用下表達上調[7]；將CkABC1p異源表達于釀酒酵母中，使釀酒酵母可將包括氟康唑、伊曲康唑、酮康唑及伏立康唑在內的抗真菌藥物外排出細胞，說明該蛋白是藥物外排轉運蛋白[22]。

2.4 煙曲霉

煙曲霉基因組中可能存在49個ABC和278個MFS 轉運蛋白，數(shù)量是釀酒酵母的4倍，但只有少數(shù)與煙曲霉臨床耐藥相關[23]。目前，對于煙曲霉ABC或MFS外排轉運蛋白與抗真菌耐藥性相關的數(shù)據(jù)較少。研究發(fā)現(xiàn)，部分唑類耐藥臨床株的外排轉運蛋白表達量較敏感株上調。atrF基因屬于ABC 轉運蛋白的PDR家族，是構巢曲霉AtrA 和 AtrB轉運蛋白的同源蛋白，給予該菌亞致死濃度的伊曲康唑，可使其基因表達水平上調為基礎水平的5倍[24]。體外誘導煙曲霉耐藥研究發(fā)現(xiàn)，其耐藥是由藥物靶位點CYP51A基因突變及藥物外排泵（MDR1、MDR2、MDR3、MDR4和atrF）表達量的上調等多種機制共同作用所致[25,26]。AfuMDR1和AfuMDR2是通過ABC 外排泵特異性引物在煙曲霉中擴增出來的MDR家族轉運蛋白，與構巢曲霉的AtrD和黃曲霉的AflMDR1具有高度同源性。在釀酒酵母中過量表達AfuMdr1p，可使其對西洛芬凈（棘白菌素B類似物）耐受性增加[27]，但未有對其它抗真菌藥物的耐藥表型。煙曲霉轉運蛋白abcA 屬于PDR轉運蛋白家族，但煙曲霉abcA基因缺陷株對于所有抗真菌藥物的敏感性未發(fā)生變化。紫外線誘導突變獲得的26株伊曲康唑煙曲霉耐藥株中，其中8株在AfuCYP51A 的G54位點發(fā)生唑類藥物耐藥相關氨基酸突變；而50%的突變株AfuMDR3與AfuMDR4基因表達量明顯上調[26]。AfuMDR3蛋白具有MFS家族轉運蛋白的典型結構，AfuMDR4蛋白具有ABC家族轉運蛋白的典型結構；但目前仍沒有數(shù)據(jù)表明煙曲霉伊曲康唑耐藥表型與AfuMDR3和AfuMDR4具有直接相關性，但以上研究說明藥物外排轉運蛋白在曲霉屬真菌對唑類藥物耐藥的形成過程中也發(fā)揮了一定作用。

2.5 隱球菌屬

新生隱球菌和格特隱球菌是重要的人類病原真菌，其兩性霉素B及氟康唑耐藥臨床株和體外誘導突變株既往均有報道[28]。新生隱球菌可能存在54個ABC和159個MFS轉運蛋白[29]，但只有CneAfr1p和CneMdr1p與新生隱球菌耐藥性相關[5,30]。CneAfr1p是ABC轉運蛋白PDR家族成員，與構巢曲霉AtrBp、煙曲霉AfuAtrFp、釀酒酵母ScSnq2p和光滑念珠菌CgPdh1p具有高度同源性[5]。新生隱球菌CneAfr1p高表達株在體外具有較強的唑類藥物耐藥性，該菌株感染的小鼠對于任何唑類藥物均無治療反應，且菌株表現(xiàn)出更強的致病性[30]。在給予氟康唑或伊曲康唑長期維持治療的過程中，隱球菌會出現(xiàn)獲得性耐藥。對臨床耐藥株的研究發(fā)現(xiàn)，氟康唑中度耐藥株多數(shù)發(fā)生CneERG11基因點突變，而高度耐藥株則藥物外排泵表達上調。CneMdr1p屬于ABC轉運蛋白MDR家族；與AflMDR1和AfuMDR1具有高度同源性；該基因的表達與唑類藥物耐藥的相關性，在新生隱球菌臨床耐藥株和體外誘導突變株中均得到證實。

3 結論

真菌中的外排轉運蛋白，特別是ABC轉運子和MFS轉運蛋白超家族，在真菌致病過程中所起的作用至關重要。大量的研究證實其可將細胞內的毒性代謝產(chǎn)物和真菌毒素運輸至胞外，清除宿主合成的抗真菌成分，使真菌對于臨床抗真菌藥物產(chǎn)生耐藥。認識每個外排轉運蛋白在臨床真菌耐藥中所發(fā)揮的作用，對于早期檢測相應臨床耐藥株、研發(fā)特異性外排泵阻斷劑及降低深部真菌感染患者的死亡率至關重要。目前，較為深入的研究主要集中于釀酒酵母和白念珠菌，而其它病原真菌具有更多的ABC和MFS轉運蛋白，特別是重要的致病絲狀真菌曲霉菌，仍需要進一步更為全面而深入的研究。

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The progress of research on efflux pumps in pathogenic fungi and drug resistant

LIAO Yong, AO Jun-hong, YANG Rong-ya
Department of Dermatology, General Hospital of Beijing Region of PLA., Beijing 100700, China

Only after overcoming both the host defenses system and antifungal treatment, maybe the pathogenic fungi can successfully maintain its colonization and eventually lead to the infection of the host. Efflux pumps in fungi play an important role in this process, mainly including the ATP-binding cassette (ABC) pumps and the major facilitator superfamily (MFS) transporters. Through coupling transport with ATP hydrolysis or a proton gradient respectively, they can transport and remove the intracellular toxic chemicals. Compared with other organisms, fungi have more coding genes of transporter families. These transporters of pathogenic fungi can export the compounds produced in the process of pathogenesis and antimicrobial components secreted by the host cell, meanwhile they also play an important role in resistance of the pathogenic fungi against clinical antifungals. In this review, we discussed the role of these two superfamily transporters in resistance of main pathogenic fungi.

Pathogenic fungi；Efflux pumps；Resistance；Progress [J Pract Dermatol, 2011, 4(4):215-218]

R379

A

1674-1293(2011)04-0215-04

廖 勇

2011-07-26

2011-09-14）

（本文編輯 祝賀）

國家自然基金（31050014）

100700，北京軍區(qū)總院全軍皮膚病診治中心（廖勇，敖俊紅，楊蓉婭）

廖勇，主治醫(yī)師，研究方向：醫(yī)學真菌學E-mail: liaoyong8337@yahoo.cn

敖

俊紅，E-mail: aojunhong@sina.com