潘哲爾 李 馳 吳春雷 朱雄白 黃小敬 溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院骨科 溫州 325000

原發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種常見(jiàn)的以關(guān)節(jié)軟骨慢性進(jìn)行性退變?yōu)樘卣鞯年P(guān)節(jié)疾患。一氧化氮（NO）是體內(nèi)重要的炎性介質(zhì)，對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生起著至關(guān)重要的作用[1]。本研究通過(guò)體外培養(yǎng)兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，應(yīng)用受體酪氨酸激酶抑制劑genistein干預(yù)正常和LPS誘導(dǎo)炎癥的軟骨細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)培養(yǎng)上清液中NO水平，了解受體酪氨酸激酶抑制劑genistein對(duì)軟骨細(xì)胞NO表達(dá)的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng) 物 4周齡新西蘭白兔4只，由溫州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（浙）2006-0026；普通級(jí)。

1.2 試劑與儀器 0.25%胰蛋白酶（Difco分裝，批號(hào)：25200056）；0.2%膠原酶 II（美國(guó) Sigma 公司，批號(hào)：BY06019）；20%小牛血清（DMEM，杭州四季青生物制品研究所，批號(hào)：69027263）；二甲基亞砜（DMSO，德國(guó)Merk公司）；受體酪氨酸激酶抑制劑genistein（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：G6649，根據(jù)需要用DMSO配制成不同濃度的溶液，置于-20℃保存）；青霉素、鏈霉素（上海四藥有限公司）；LPS（北京邦定泰克生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：L5418）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞原代培養(yǎng) 4周齡新西蘭白兔4只，于無(wú)菌條件下切取股骨髁和脛骨平臺(tái)關(guān)節(jié)軟骨，Hank's液漂洗3次后，剪成1mm×1mm×1mm大小，以0.25%胰蛋白酶37℃預(yù)消化15min，然后用0.2%膠原酶37℃消化，每45min收集一次消化產(chǎn)物，共4次。每次收集的消化產(chǎn)物經(jīng)篩網(wǎng)過(guò)濾、1000rpm離心5min后棄上清，所分離得到細(xì)胞用Hank's液漂洗離心3次，加入20%小牛血清DMEM培養(yǎng)液，以2×105/cm2接種于25cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置入D-6450型細(xì)胞培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）培養(yǎng)。

2.2 細(xì)胞換液和傳代 細(xì)胞培養(yǎng)用具均高壓滅菌30min，超凈臺(tái)以紫外線照射消毒＞30min。48h換液消除未貼壁細(xì)胞和組織，以后隔日換液。顯微鏡下觀察貼壁生長(zhǎng)的單層細(xì)胞融合成片時(shí)即可傳代。倒去培養(yǎng)瓶中陳舊性培養(yǎng)基，以少量Hank's液洗去培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)殘存培養(yǎng)基，重復(fù)操作兩次，加入0.25%胰蛋白酶，37℃消化1～2min，顯微鏡下觀察到細(xì)胞重新變成圓形后，吸去胰酶消化液。加入適量培養(yǎng)基，吸管輕輕吹打使細(xì)胞離壁并懸浮于培養(yǎng)基中。1000rpm離心5min后以適量培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，重復(fù)操作2次。將傳代細(xì)胞接種于25cm2培養(yǎng)瓶（密度2×105/cm2），鏡下觀察細(xì)胞達(dá)到亞融合狀態(tài)后，換1%血清培養(yǎng)基過(guò)夜。

2.3 分組及干預(yù) 設(shè)置正常對(duì)照組、LPS刺激組以及LPS刺激+不同濃度genistein干預(yù)組共7組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，LPS刺激濃度為10μg/mL，genistein干預(yù)濃度分別為 5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL 及25μg/mL；分別在培養(yǎng)第 1、2、3、4 天時(shí)，測(cè)定軟骨細(xì)胞培養(yǎng)上清液NO水平。

2.4 亞硝酸鹽測(cè)定 根據(jù)Griess氏[2]反應(yīng)法，加以改進(jìn)。在酶標(biāo)板內(nèi)加入細(xì)胞上清液100μL，加入1%對(duì)氨基苯磺酰胺50μL，4℃放置15min，再加入0.1%萘基乙二胺，室溫30min后放置于酶標(biāo)儀595nm處讀取OD值。以10～100μM的亞硝酸鹽溶液作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 體外軟骨細(xì)胞培養(yǎng)和形態(tài)觀察 原代分離的軟骨細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液中，靜置24h后大部分細(xì)胞沉降于培養(yǎng)瓶壁上，72h后完全貼壁，12～14天鋪滿瓶底形成單層，部分區(qū)域可呈集落樣生長(zhǎng)或多層生長(zhǎng)。傳代的細(xì)胞一般24h即可完成貼壁，5～7天達(dá)到亞融合狀態(tài)，生長(zhǎng)分裂能力強(qiáng)于原代細(xì)胞，見(jiàn)圖1。前2代細(xì)胞增殖、分化能力較強(qiáng)，細(xì)胞擴(kuò)增率明顯高于其他代。隨著傳代次數(shù)增加，細(xì)胞去分化現(xiàn)象明顯，梭形細(xì)胞增多，增殖能力下降，傳代周期延長(zhǎng)。本研究選用第二代軟骨細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

3.2 各組體外細(xì)胞培養(yǎng)液NO水平比較 細(xì)胞培養(yǎng)液中亞硝酸鹽含量測(cè)定顯示，空白對(duì)照組即正常關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞不產(chǎn)生NO，在LPS刺激下可產(chǎn)生NO，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，NO水平逐漸增加，genistein干預(yù)后上清液NO的水平有一定程度下降，且下降水平與genistein干預(yù)濃度和時(shí)間相關(guān)?？瞻讓?duì)照組與LPS組、與不同濃度genistein干預(yù)組之間兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；LPS組與LPS+genistein5μg/mL、10μg/mL干預(yù)組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；LPS 組與 LPS+genistein15μg/mL、20μg/mL及25μg/mL各干預(yù)組之間兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表 1。

表1 各組體外軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液NO水平比較（） nmoL/L

表1 各組體外軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液NO水平比較（） nmoL/L

注：與空白組比較，*P＜0.05；與 LPS 組比較，△P＜0.05；

培養(yǎng)時(shí)間/d/（μg/mL）1234空白對(duì)照組 0 0.30±0.07 0.27±0.09 0.25±0.04 0.31±0.10 LPS 組 0 3.52±0.63* 6.56±0.78* 12.54±1.02* 13.12±0.61*LPS+genistein 組 5 3.26±0.36* 6.21±0.81* 11.78±0.69* 12.59±0.57*10 2.79±0.20* 6.01±0.54* 11.01±0.43* 11.95±0.23*15 2.02±0.47*△ 5.24±0.31*△ 10.56±0.27*△ 10.41±0.35*△20 1.61±0.39*△ 3.89±0.45*△ 9.69±0.35*△ 10.21±0.51*△25 1.59±0.27*△ 4.25±0.19*△ 8.57±0.63*△ 9.75±0.39*△組 別 genistein濃度

4 討論

軟骨細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中出現(xiàn)兩種轉(zhuǎn)歸：一是繼續(xù)維持表型，二是發(fā)生反分化。Tamamura等[3]通過(guò)測(cè)定II型膠原和蛋白多糖的變化，認(rèn)為傳代對(duì)細(xì)胞表型影響很大，國(guó)內(nèi)張志光等[4]研究認(rèn)為，在5代以內(nèi)軟骨細(xì)胞表型保持穩(wěn)定，但這可能與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的年齡、細(xì)胞接種的密度以及培養(yǎng)的條件相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)觀察到三代以內(nèi)的軟骨細(xì)胞活性較強(qiáng)，三代以后的細(xì)胞逐漸出現(xiàn)反分化。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)第二代軟骨細(xì)胞活性較高，是理想的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，所以我們選用第二代軟骨細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

自1997年Stadler[5]首先報(bào)道兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞能產(chǎn)生NO以來(lái)，人們開(kāi)始研究NO與關(guān)節(jié)軟骨之間的相互關(guān)系；并發(fā)現(xiàn)NO在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎的軟骨及關(guān)節(jié)液中含量明顯升高，且具有重要的病理生理作用。NO在人體內(nèi)以相對(duì)特異的方式控制多種細(xì)胞生理功能，一方面，NO通過(guò)鳥(niǎo)苷酸途徑及多種非鳥(niǎo)苷酸依賴性途徑影響基因轉(zhuǎn)錄、翻譯及翻譯后加工；另一方面，NO是一種細(xì)胞毒性分子，可造成組織損傷[6]。軟骨細(xì)胞在受到LPS刺激下，合成高濃度的NO，可增加關(guān)節(jié)軟骨中膠原酶和金屬蛋白酶（MMPS）的活性[7]，促進(jìn)蛋白聚糖及膠原的裂解，引起OA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞異常凋亡[8]。因此，研究如何減少關(guān)節(jié)內(nèi)NO的產(chǎn)生，成為預(yù)防、治療骨關(guān)節(jié)炎的一個(gè)途徑。

蛋白酪氨酸激酶（PTK）是蛋白磷酸化激酶家族中重要的成員之一，在炎癥、腫瘤等疾病的一系列細(xì)胞活動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起著重要作用。PTK處于整個(gè)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑的上游部分，通過(guò)磷酸化底物蛋白的酪氨酸殘基而使其激活，參與多條信號(hào)途徑。資料表明，蛋白酪氨酸激酶的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在軟骨細(xì)胞產(chǎn)生NO方面起著重要的作用[9]，其可能是通過(guò)核因子-KB（NF-KB）參與一氧化氮合酶（iNOS）的基因調(diào)控[10]，達(dá)到調(diào)控NO水平的作用。

有研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的大鼠軟骨細(xì)胞表達(dá)盤(pán)狀結(jié)構(gòu)域受體2（DDR2），DDR2是一類特殊的受體型PTK[11]，廣泛分布于人體的多種組織，DDR2的表達(dá)水平與基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPS）的表達(dá)成正相關(guān)[12]，在骨關(guān)節(jié)炎中DDR2的表達(dá)明顯升高，這些都提示蛋白酪氨酸激酶在骨關(guān)節(jié)炎癥的發(fā)病機(jī)制中可能存在重要作用。本實(shí)驗(yàn)使用的genistein是第一個(gè)天然的多靶點(diǎn)的受體酪氨酸激酶抑制劑，常用于腫瘤細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制研究中，對(duì)多種蛋白的酪氨酸激酶活性具有抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞不產(chǎn)生NO，LPS刺激組表達(dá)較高濃度的NO，LPS+不同濃度genistein干預(yù)組，則部分抑制NO產(chǎn)生，且與genistein呈現(xiàn)一定的濃度和時(shí)間相關(guān)性。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道LPS能通過(guò)誘導(dǎo)iNOS表達(dá)，合成高濃度NO，推測(cè)genistein抑制NO產(chǎn)生的作用可能是通過(guò)抑制iNOS表達(dá)而實(shí)現(xiàn)[13]，且抑制程度與genistein濃度和干預(yù)時(shí)間相關(guān)。

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