高世勇，劉 溪，季宇彬

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，哈爾濱 150076;2.國家教育部抗腫瘤天然藥物工程研究中心，哈爾濱 150076)

《本經(jīng)》、《本草綱目》等中藥專著中記載，吳茱萸主溫中下氣，止痛，咳逆寒熱，除濕，血痹，逐風(fēng)邪，開腠理，治吞酸，厥陰痰涎頭痛，陰毒腹痛，疝氣血?。?］.吳茱萸堿是色胺吲哚類生物堿，是吳茱萸主要的生物堿類化合物，其分子式為C19H17N3O，分子質(zhì)量為303.36，結(jié)構(gòu)式如圖1.吳茱萸堿的藥理作用在近些年越來越受到關(guān)注.國內(nèi)外研究表明吳茱萸堿對于心臟［2－3］、內(nèi)分泌系統(tǒng)［4－5］、支氣管平滑?。?］及胃腸道［7］等均具有較強(qiáng)藥理作用，并且具有抗炎鎮(zhèn)痛［8］、減肥的作用［9］，還能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫力［10－11］等.體內(nèi)、體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)可知，吳茱萸堿對 HeLa人宮頸癌［12］、A375－S2人黑色素瘤［13－14］、MCF7 人乳腺癌［15］、NCI/ADR－RES 人耐藥乳腺癌［16］等多種腫瘤細(xì)胞株均有細(xì)胞毒作用;而吳茱萸堿對人肝癌HepG-2細(xì)胞作用的報道很少，其對HepG-2細(xì)胞周期影響及機(jī)制的研究未見報道.本實(shí)驗(yàn)研究吳茱萸堿對HepG-2細(xì)胞周期的阻滯作用，并且確定其對HepG-2細(xì)胞內(nèi)微管蛋白聚集形態(tài)的影響.

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞株

人肝癌HepG-2細(xì)胞是由黑龍江省腫瘤醫(yī)院腫瘤藥物研究所提供.

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

吳茱萸堿(Evodiamine)藥物純度大于98%、胰蛋白酶、碘化丙錠 (PI)、二甲基亞砜(DMSO)購自于Sigma藥物公司;羥基喜樹堿(HCPT)購自于上海龍翔生物醫(yī)藥公司;RPMI1640培養(yǎng)基購自于GIBCO公司;Tubulin抗體、FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)購自于碧云天生物技術(shù)研究所;胎牛血清購自于杭州四季青生物工程公司;MTT粉末(噻唑藍(lán))購自于Molecular Probe公司.

1.2 儀器設(shè)備

二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(CO-150型)購自于美國NBS公司;超凈工作臺(DL-CJ-1N醫(yī)用型)購自于北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;全自動酶標(biāo)儀(680型)購自于美國Bio-Rad公司;流式細(xì)胞儀(EPICS–XL型)購自于美國Beckman Coulter公司;激光共聚焦顯微鏡(SP2型)購自于德國Leica公司;微量振蕩儀(TL-2000MMⅢ型)購自于姜堰市天力醫(yī)療器械公司;熒光倒置顯微鏡(CKX-41-32型)購自于日本OLYMPUS公司.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將人肝癌HepG-2細(xì)胞以適當(dāng)濃度接種在細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，于溫度為恒37℃、CO2為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，每2 至3 d傳代［17］.

2.2 采用MTT法檢測吳茱萸堿對人肝癌細(xì)胞HepG-2的增殖抑制作用

取對數(shù)生長期的HepG-2細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，加入培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞濃度調(diào)整為2 ×104個/mL，接種于 96 孔板中，每孔100μL，置于37℃、5%CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，加入不同濃度的吳茱萸堿，每孔100μL，每個劑量設(shè)置6個平行孔;陰性對照組加入同等體積的RPMI1640，陽性對照組加入羥基喜樹堿，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，吸去上清，加入濃度為0.5mg/mLMTT溶液，每孔加入100μL，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，棄去上清，每孔加入150μL DMSO，微量振蕩器振蕩5min，充分混勻后，酶標(biāo)儀以檢測波長570 nm條件下測定吸光度 (OD值).根據(jù)所測吸光度值計算抑制率以及IC50.

抑制率 =(對照組OD值-給藥組 OD值 )/對照組OD值×100%

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測吳茱萸堿對HepG-2細(xì)胞周期的作用

以細(xì)胞濃度為2×105個/mL的人肝癌細(xì)胞HepG-2鋪于六孔板中，孵育24 h后，以三種不同濃度的吳茱萸堿繼續(xù)孵育24 h后，收集細(xì)胞，以2000 r/min、10min離心，棄去上清，用70%的冰乙醇，在4℃環(huán)境下固定過夜，經(jīng)PI染液(PI 2.5mg，Rnase 0.5mg 及 Trtiton-X-1000.25mL)800μL，避光染色30min后，過500目尼龍網(wǎng)過濾，流式細(xì)胞儀(FCM)進(jìn)行檢測，激發(fā)波長為488 nm.

2.4 免疫熒光染色、激光共聚焦顯微鏡檢測吳茱萸堿對HepG-2細(xì)胞微管蛋白的影響

取對數(shù)生長期的人肝癌HepG-2細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化，加入3mL含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，吹打成細(xì)胞懸液，調(diào)整懸液濃度為1×105個/mL，將其接種于放有已滅菌蓋玻片的六孔板中培養(yǎng)24 h，分別加入終濃度為 10、20、40μmol/L 的吳茱萸堿，并同時設(shè)計陰性對照組及陽性對照羥基喜樹堿組，在培養(yǎng)箱中孵育24 h.PBS緩沖液洗2次，每次1min.4%多聚甲醛固定細(xì)胞40min，PBS緩沖液洗2次，每次1min.加入0.1%TritonX-100，在室溫下孵育30min后，PBS緩沖液洗1次.每孔加入BSA室溫封閉2 h后，PBS洗3次，每次1min，濾紙吸干多余PBS.加入微管蛋白抗體(1∶500稀釋)，4℃條件下濕盒中孵育過夜.加入PBS洗3次，每次1min.繼續(xù)加入FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1∶500稀釋)，濕盒中室溫孵育2 h，PBS緩沖液洗3次.采用無熒光甘油(甘油∶PBS=9∶1)封片，在激光共聚焦顯微鏡CLSM下觀察、拍照，檢測條件為吸收波長490～495 nm，激發(fā)波長520～530 nm.

2.5 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)處理

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 吳茱萸堿對人肝癌HepG-2細(xì)胞的細(xì)胞毒作用

吳茱萸堿對人肝癌 HepG-2細(xì)胞的 IC50為19.62μmol/L，如表 1.

表1 吳茱萸堿對人肝癌細(xì)胞HepG-2增殖的影響

3.2 流式細(xì)胞儀分析吳茱萸堿對人肝癌細(xì)胞HepG-2細(xì)胞周期的阻滯作用

經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測分析表明，吳茱萸堿以2.5、5、10μmol/L 作用 HepG-2 人肝癌細(xì)胞 24 h后，G2/M期比例分別為 18.591%、22.613%及24.424%，如表2.結(jié)果表明，吳茱萸堿可將HepG-2細(xì)胞周期阻滯于G2/M期.

表2 流式細(xì)胞儀測得吳茱萸堿對HepG-2細(xì)胞G2/M期分布的變化

3.3 免疫熒光染色、激光共聚焦顯微鏡觀察吳茱萸堿對人肝癌細(xì)胞HepG-2微管蛋白的影響

如圖1，可見陰性對照組的人肝癌HepG-2細(xì)胞的微管蛋白呈網(wǎng)絡(luò)狀，微管蛋白纖維為清晰的絲狀，并且由細(xì)胞中心、沿著細(xì)胞長軸向四周輻射分布.經(jīng)吳茱萸堿的給藥組則可見微管蛋白分布形態(tài)紊亂，由長條型變?yōu)椴灰?guī)則型、圓形;隨著給藥劑量的增加，微管蛋白排列方式由原有的輻射狀變?yōu)槌适鵂罘植迹蚣?xì)胞的一側(cè)聚合，呈斑塊狀亮綠色.表明吳茱萸堿可使細(xì)胞微管蛋白的聚合態(tài)發(fā)生改變.

圖1 HepG-2細(xì)胞內(nèi)微管蛋白免疫熒光染色

4 討論

通過流式細(xì)胞儀檢測分析可知吳茱萸堿將人肝癌HepG-2細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，各終濃度給藥組與陰性對照組相比G2/M期所占百分比均顯著提高.在G2/M期時細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂，而在細(xì)胞有絲分裂過程中微管起著關(guān)鍵性作用，由此，進(jìn)一步通過免疫熒光技術(shù)，經(jīng)抗體特異性標(biāo)記HepG-2細(xì)胞內(nèi)微管蛋白α-tubulin，激光共聚焦顯微鏡觀察微管蛋白的聚合狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)微管蛋白由清晰絲狀網(wǎng)絡(luò)態(tài)變?yōu)槭鵂罘植?實(shí)驗(yàn)表明，吳茱萸堿能夠發(fā)揮其顯著的抗腫瘤作用，是通過影響微管蛋白的聚合形態(tài)(即以微管為靶點(diǎn))，即微管蛋白由輻射狀變?yōu)槭鵂罹酆?，進(jìn)而干擾紡錘體的形成，阻斷腫瘤細(xì)胞HepG-2的有絲分裂進(jìn)程，誘導(dǎo)其細(xì)胞周期阻滯于G2/M期.而吳茱萸堿對微管的作用機(jī)制將會被在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)，比如吳茱萸堿對有絲分裂促進(jìn)因子MPF及微管蛋白相關(guān)蛋白MAP的調(diào)控.

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