臧玲玲,李永吉,孫 凌,郭玉巖,管慶霞,楊志欣,侯 佳
(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,哈爾濱 150040)
青風(fēng)藤為防己科植物青藤和毛青藤的干燥藤莖,臨床常用于治療風(fēng)濕、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及心率失常等[1-2].藥效物質(zhì)基礎(chǔ)為青藤堿,青藤堿的有效提取,直接影響青風(fēng)藤的藥效發(fā)揮,因此,本文通過對(duì)不同的提取純化方法的比較,優(yōu)選出青風(fēng)藤的最佳精制工藝,為工藝放大生產(chǎn)提供參考,現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下.
青風(fēng)藤藥材(購(gòu)自哈爾濱藥材市場(chǎng)).青藤堿對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所提供,批號(hào)0775—200105).甲醇(色譜純,DIKMA TECHNOLOG INC),實(shí)驗(yàn)所用其他試劑均為分析純.
Waters高效液相色譜儀,含有在線脫氣、高壓四元梯度泵、恒溫自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器(DAD)、Empower色譜工作站(美國(guó));分析天平(Sartorius CP225D);酸度計(jì)(梅特勒-托利多DELTA 320).
取400 g青風(fēng)藤藥材,用8倍量的70%乙醇,連續(xù)回流提取2次,每次1 h,合并提取液,濾過,濾液濃縮至250mL,用微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得.
1)方法 1[3]:精密量取 30mL 藥液蒸干,用2%鹽酸25mL溶解,濾過,濾液加氨試液調(diào)pH值至10,用氯仿萃取2次,每次20mL,合并氯仿層,氯仿液蒸干,得青藤堿精提物.2)方法2:精密量取30mL藥液蒸干,用2%鹽酸25mL溶解,濾過,濾液加氨試液調(diào)pH值至10,用氯仿萃取2次,每次20mL,合并氯仿層;取氯仿萃取液,加2%鹽酸水溶液萃取2次,每次40mL,收集鹽酸水溶液層,加氨試液調(diào)pH值至10后,再加氯仿萃取2次,每次80mL,收集氯仿液,蒸干,得青藤堿精提物.3)方法3:精密量取30mL藥液蒸干,用2%鹽酸25mL溶解,濾過,濾液加氨試液調(diào)pH值至10,用氯仿萃取2次,每次20mL,合并氯仿層;取氯仿萃取液,加2%鹽酸水溶液萃取2次,每次40mL,收集鹽酸水溶液層,加氨試液調(diào)pH值至10后,再加氯仿萃取2次,每次80mL,收集氯仿液,再加2%鹽酸水溶液萃取2次,每次160mL,收集鹽酸水溶液層,加氨試液調(diào)pH值至10后,再加氯仿萃取2次,每次320mL,收集氯仿液,蒸干,得青藤堿精提物.
DIKMA Diamonsil ODS C18色譜柱(250×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L磷酸氫二鉀溶液加1‰三乙胺,用磷酸調(diào)pH值至3.0)∶甲醇(80∶20);流速為 1.0mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)265 nm;柱溫25℃:進(jìn)樣量10μL.理論塔板數(shù)按青藤堿計(jì)算應(yīng)不低于2000.
取干燥至恒重的青藤堿對(duì)照品2.82mg,精密稱定,置100mL量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得.
精密吸取上述“2.2”項(xiàng)下的各方法精制樣品適量.甲醇溶解,定容至1000mL量瓶中,濾過,進(jìn)樣.
精密吸取已制備好的對(duì)照品和“2.2.3”項(xiàng)下的樣品,照“3.1”項(xiàng)下色譜條件,各進(jìn)樣 10μL,色譜圖見圖1.結(jié)果表明,樣品與對(duì)照品溶液均在相同保留時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)青藤堿吸收峰,說明本試驗(yàn)條件下青藤堿峰與其他組分峰分離完全.
圖1 青藤堿HPLC圖譜
取青藤堿對(duì)照品精密稱定為4.46mg,置10mL量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度作為儲(chǔ)備液(質(zhì)量濃度為 0.446mg/mL).精密吸取 1、2、7、8mL置10mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,得質(zhì)量濃度為 0.0446、0.0892、0.3122、0.3568mg/mL 的對(duì)照品溶液及質(zhì)量濃度為0.446mg/mL的儲(chǔ)備液,分別進(jìn)樣10μL,測(cè)定峰面積,以對(duì)照品質(zhì)量濃度(C)對(duì)峰面積(A)進(jìn)行線性回歸,得回歸方程為:Y=9E+06X+102803(R=0.9999).結(jié)果表明,青藤堿在0.0446~0.446mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi),線性關(guān)系良好.
精密吸取對(duì)照品溶液5份,按“3.2”項(xiàng)下條件測(cè)定,計(jì)算質(zhì)量濃度及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差.結(jié)果RSD=1.25%(n=5),表明測(cè)定精密度良好.
精密吸取按方法3項(xiàng)下條件制備溶液,分別放置 2、4、8、10、12 h,測(cè)定其峰面積,計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差.結(jié)果RSD=0.58%,表明樣品在放置12 h內(nèi)穩(wěn)定.
精密稱取對(duì)照品10.34mg,置10mL量瓶中,用甲醇溶解,作為儲(chǔ)備液.精密移取儲(chǔ)備液各1mL,分別置9個(gè)25mL量瓶中,分別稱取按方法3制備下樣品加甲醇溶解,定容至刻度,使體積分?jǐn)?shù)成測(cè)定體積比的80%、100%、120%,各3份.進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算測(cè)得量及回收率,平均回收率為99.5%,RSD為0.45%.
分別稱取青風(fēng)藤藥材,各5 g,按“2”項(xiàng)下方法平行制成供試品溶液各2份,測(cè)定樣品中青藤堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和轉(zhuǎn)移率.結(jié)果見表1.
表1 青藤堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和轉(zhuǎn)移率的結(jié)果
本文參考相關(guān)文獻(xiàn)[3],單純用氯仿萃取(方法1),得到結(jié)果質(zhì)量分?jǐn)?shù) 35.38%,轉(zhuǎn)移率11.32%,得到青藤堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和轉(zhuǎn)移率均較低,效果不佳;為了提高青藤堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和轉(zhuǎn)移率,筆者在原有工藝的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)和優(yōu)化,選用在氯仿萃取基礎(chǔ)上,增加鹽酸水溶液的萃取(方法2),得到結(jié)果質(zhì)量分?jǐn)?shù)76.05% ,轉(zhuǎn)移率67.19%,結(jié)果有明顯改善,但仍不能達(dá)到較純精制;繼續(xù)增加氯仿、鹽酸水溶液的交替萃取(方法3),得到結(jié)果質(zhì)量分?jǐn)?shù)91.36%,轉(zhuǎn)移率79.78%,青藤堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和轉(zhuǎn)移率都有了較大的提高.結(jié)果表明,隨著氯仿、鹽酸水溶液交替萃取次數(shù)的增加,青藤堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸上升,轉(zhuǎn)移率有所提高,因此,選用方法3為最佳的青藤堿精制工藝,該方法可行、可靠、可控,為青風(fēng)藤及相關(guān)制劑的精制提供依據(jù),為制藥新工藝的推廣和應(yīng)用提供了科學(xué)方法.
采用高效液相色譜法建立了青風(fēng)藤中青藤堿含量的測(cè)定方法,通過對(duì)方法的精密度、線性關(guān)系、回收率、穩(wěn)定性等考察,驗(yàn)證本法精密、準(zhǔn)確,為青藤堿的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供了參考依據(jù).
[1]劉 強(qiáng),周莉玲,李 銳.青藤堿的研究概況[J].中草藥,1997,28(4):247.
[2]中華人民共和國(guó)藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(Ⅰ部)[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:135.
[3]劉超英,喬 明,范衛(wèi)峰.青風(fēng)藤中青藤堿的提取分離方法比較研究[J].湖北中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2005,7(1):49-50.