王丹生，程遠(yuǎn)志，徐田軍，王日昕

（1.遼東學(xué)院農(nóng)學(xué)院，遼寧丹東 118001；2.浙江海洋學(xué)院海洋科學(xué)學(xué)院，浙江舟山 316004）

鯡形目Clupeiformes魚類共約401種，全世界范圍內(nèi)均有分布，主要集中于印度洋和西太平洋，絕大多數(shù)種類棲息于熱帶亞熱帶海洋沿岸水域，少數(shù)則適應(yīng)于淡水生態(tài)環(huán)境。鯡形目魚類包括眾多高經(jīng)濟(jì)價(jià)值種類，如鯡魚Clupea pallasi、鰣魚Tenualosa reevesii、斑鰶Clupanodom punchtatus、寶刀魚Chirocentrus dorab和鳳鱭Coilia mystus等[1-2]，是全球商業(yè)漁業(yè)資源的重要組成部分，2003年，鯡形目魚類捕獲量達(dá)到1 900×104t，占當(dāng)年全球所有魚類捕獲量的25%(FAO,Fishery statistics 2003,http://www.fao.org/fi/statist/statist.asp)。黃鯽Setipinna taty、鳳鱭隸屬于鯡形目、鳀科Engraulidae，是我國(guó)長(zhǎng)江、河口區(qū)和海洋近岸水域重要的經(jīng)濟(jì)魚類[4-5]。

鯡形目劃歸為鯡形總目Clupeomorphe，該總目包括許多白堊紀(jì)的化石類群，而鯡形目則包括了全部的現(xiàn)生種類[5]。有關(guān)鯡形目的系統(tǒng)分類，已有較為廣泛的形態(tài)學(xué)研究，在鯡形目魚類單系起源以及與骨鰾類為姐妹群關(guān)系方面觀點(diǎn)一致[1,6-8]。然而鯡形目科間與科內(nèi)系統(tǒng)分類關(guān)系目前爭(zhēng)議頗多，不同的學(xué)者由于個(gè)人觀點(diǎn)的不同，所編分類系統(tǒng)存在較大差異，如國(guó)內(nèi)孟慶聞等[9]所編分類系統(tǒng)，鯡形目分為4科：齒鯡科Denticepitidae、鯡科CIupeidae、鳀科以及寶刀魚科Chirocentridae；而NELSON[10]則將其分為5科，隸屬于孟慶聞等劃定的分類系統(tǒng)中的鯡科鰳屬Ilisha、后鰭魚屬Opisthopterus、多齒鰳屬Pellona以及鋸腹鰳屬Pristigaster被劃歸為鋸腹鰳科Pristigasteridae。另外，GRANDE[5]和PATTERSON等[11]依據(jù)肋骨同肋椎骨比例以及椎體同肋骨連接部位2個(gè)共同衍征將寶刀魚科與鯡科劃入鯡超科，相反，DI[12]依據(jù)形態(tài)學(xué)分析后指出，寶刀魚科實(shí)際上與鳀科親緣關(guān)系更近。由于形態(tài)特征容易受到環(huán)境因素的影響，不同魚類長(zhǎng)期在相似的生境中發(fā)展可能會(huì)使外部及骨骼形態(tài)表現(xiàn)出趨同性，僅利用形態(tài)特征對(duì)其分類會(huì)存在一定的偏差。分類上的混亂與爭(zhēng)議不僅影響鯡形目魚類系統(tǒng)進(jìn)化研究，也會(huì)在一定程度上對(duì)養(yǎng)殖生產(chǎn)中苗種及親本鑒定造成困難，尤其是在人工繁育過程中，物種鑒定錯(cuò)誤有可能在繁育過程中出現(xiàn)雜交現(xiàn)象而使人工繁育歸于失敗[13]，因而有必要對(duì)鯡形目魚類系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系尤其是爭(zhēng)議問題進(jìn)行更為深入的研究以明確其分類關(guān)系。

物種進(jìn)化的歷程被DNA所忠實(shí)地記錄，通過研究物種DNA序列變異信息，可追溯物種進(jìn)化歷史，為重建系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系提供重要線索[14-15]。隨著近年來DNA分子標(biāo)記技術(shù)與分子系統(tǒng)學(xué)的快速發(fā)展，基于基因序列和分子數(shù)據(jù)對(duì)魚類親緣關(guān)系的分析以及種屬鑒定得到廣泛應(yīng)用，較好地確定了許多形態(tài)上難以界定的分類關(guān)系。Cyt b基因進(jìn)化速度適中，易用通用引物擴(kuò)增和測(cè)序，且是線粒體基因組中唯一的結(jié)構(gòu)與功能了解較為清楚的蛋白質(zhì)編碼基因，在魚類分子系統(tǒng)學(xué)研究中應(yīng)用較為廣泛。區(qū)又君等[16]通過測(cè)定4種石斑魚的Cyt b基因全長(zhǎng)序列，并結(jié)合Genbank中7種石斑魚同源序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，支持將鞍帶石斑魚Epinephelus lanceolatus歸入石斑魚屬Epinephelus。章群等[17]利用Cyt b基因序列分析了鱖類的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系后認(rèn)為長(zhǎng)體鱖Siniperca roulei應(yīng)從長(zhǎng)體鱖屬Siniperca劃入到鱖屬Siniperca中。莊軒等[13]通過分析石斑魚亞科Epinephlinal 6屬28種Cyt b基因片段序列，從分子系統(tǒng)學(xué)角度研究了其分化順序以及親緣關(guān)系等。但是應(yīng)用線粒體序列變異研究鯡形目魚類系統(tǒng)進(jìn)化則鮮有報(bào)道。

本研究以我國(guó)東海舟山海域黃鯽、鳳鱭為研究對(duì)象，測(cè)定了其Cyt b基因全長(zhǎng)序列，并結(jié)合所有已發(fā)布的鯡形目魚類Cyt b基因序列，進(jìn)行分子系統(tǒng)學(xué)分析，探討鯡形目魚類系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，與形態(tài)學(xué)研究相互印證補(bǔ)充，以期從DNA水平為其系統(tǒng)進(jìn)化提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與總DNA提取

黃鯽、鳳鱭個(gè)體采集于浙江省舟山市沈家門碼頭，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定確認(rèn)后剪取部分尾鰭用于總DNA提取。參照薩姆布魯克等[18]方法，抽提總DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量和濃度，將所得DNA溶于TE溶液中-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 Cyt b基因擴(kuò)增

Cyt b-F:5’-GTG ACT TGA AAA ACC ACC GTT-3’和 Cyt b-R:5’-CTC CAT CTC CGG TTT ACA A－GA C-3’，用以擴(kuò)增黃鯽、鳳鱭的 Cyt b 基因全長(zhǎng)[19]。PCR 擴(kuò)增體系為 50 μL，包括：模板 2 μL，10×Reaction Buffer 5 μL，dNTP 各 0.2 mmol/L，上、下游引物各 0.2 μmol/L，Taq DNA 聚合酶 2 U，MgCl21.5 mmol/L。反應(yīng)在Bio-Rad Mycycler PCR儀上進(jìn)行。循環(huán)參數(shù)設(shè)置為：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸60 s，循環(huán)30次，最后于72℃延伸10 min。每組反應(yīng)均設(shè)不含模板的空白對(duì)照。1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.3 純化回收，TA克隆與測(cè)序

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后，割取目的帶，利用TIANGEN瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化回收目的產(chǎn)物。將純化后的Cyt b的PCR產(chǎn)物與PMD-19T載體16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化進(jìn)DH5α感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化子于涂有IPTG和X-gal含氨芐青霉素的LB平板上37℃培養(yǎng)15 h，藍(lán)白斑篩選，挑取單克隆用M13F/M13R引物雙向測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用DNAstar程序包中的SeqMan進(jìn)行序列拼接，獲得黃鯽、鳳鱭的Cyt b基因全長(zhǎng)序列。從Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載所有已發(fā)布的鯡形目魚類Cyt b基因全長(zhǎng)序列（表1）。利用MEGA4軟件進(jìn)行所有Cyt b基因序列比對(duì)，并計(jì)算變異位點(diǎn)數(shù)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)數(shù)、堿基替換百分比、轉(zhuǎn)換顛換比率、相對(duì)遺傳距離、堿基組成與密碼子使用頻率。采用鄰接法（NJ），以南美肺魚Lepidosiren paradoxus為外群建立鯡形目系統(tǒng)發(fā)生樹，自舉檢驗(yàn)1 000次評(píng)估系統(tǒng)樹各分枝的置信度。

表1 本研究所用物種，Cyt b基因登錄號(hào)Tab.1 The list of species，Cyt b gene sequences accession numbers used in this study

2 結(jié)果與討論

2.1 Cyt b基因序列變異與堿基組成特征

經(jīng)克隆測(cè)序所得黃鯽、鳳鱭的Cyt b基因序列全長(zhǎng)為1 141 bp，編碼380個(gè)氨基酸，序列長(zhǎng)度與編碼氨基酸個(gè)數(shù)同已報(bào)道的絕大多數(shù)魚類一致，如圖1所示。Blast比較分析也顯示兩者同其他鯡形目魚類Cyt b基因具極高的相似性[19-21]。序列提交至Genbank，獲得序列號(hào)，見表1。經(jīng)比對(duì)分析所有43個(gè)鯡形目魚類Cyt b基因全長(zhǎng)后，共檢測(cè)出變異位點(diǎn)553個(gè)，占全部序列的48.5%，其中504個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)。總體而言，序列中轉(zhuǎn)換多于顛換，Ts/Tv為2.448，明顯大于2，表明所分析的Cyt b基因的突變并未達(dá)到飽和狀態(tài)，其中T-C轉(zhuǎn)換多于A-G，A-T和A-C的顛換多于G-T和G-C。T、C、A和G堿基的平均含量分別為28.8%、29.0%、25.2%和17.0%，A+T平均含量為54%，大于G+C的含量，同已報(bào)道的脊椎動(dòng)物Cyt b基因以及整個(gè)線粒體基因組的堿基組成特征一致[22]。密碼子第三位G堿基（G-3）的平均含量為9.5%，明顯低于其余3種堿基含量，表現(xiàn)出反G偏倚，見表2。但是，不同種類Cyt b基因G-3含量存在較大個(gè)體差異性，例如沙丁魚G-3含量為20.8%，大于A-3的含量（20.3%），而在鱷粗齒鳀中，卻表現(xiàn)出極強(qiáng)的反G偏倚，G-3含量?jī)H為1.8%。另外，一部分鯡形目魚類，如遠(yuǎn)東擬沙丁魚、擬沙丁魚以及美洲擬沙丁的Cyt b基因G-3盡管表現(xiàn)出反G偏倚，但仍具有較高含量。在高級(jí)脊椎動(dòng)物中，如鳥類和哺乳類中則有發(fā)現(xiàn)Cyt b基因密碼子第三位表現(xiàn)出反A和C堿基[23-24]。目前尚不清楚這些差異是否表明各個(gè)主要?jiǎng)游镱惾哼m應(yīng)于不同的進(jìn)化道路從而定向地累積了不同的變異，值得進(jìn)一步的研究。

圖1 黃鯽與鳳鱭Cyt b基因序列比較Fig.1 Comparison of complete sequence of Cyt b gene in S.tay and C.mystus

表2 鯡形目魚類Cyt b基因堿基組成Tab.2 Base composition of Cyt b gene of Clupeiformes fishes

2.2 鯡形目Cyt b基因密碼子分布

利用MEGA4軟件分析Cyt b基因密碼子分布情況，結(jié)果表明密碼子分布存在偏性。使用最多的密碼子為亮氨酸（CUA），平均為1.89%，其次是Cyt（GGA），平均為1.86%；使用最少的密碼為絲氨酸（AGU），為0.05%。在具有4個(gè)或2個(gè)同義密碼子的氨基酸中，以C堿基結(jié)尾的密碼子占最多數(shù)，其次為A堿基結(jié)尾的密碼子，見表3。研究發(fā)現(xiàn)，雖然脊椎動(dòng)物mtDNA編碼的蛋白基因在序列上存在很大差異，但其中絕大部分為同義替代，且主要發(fā)生在密碼子第3位，該位置存在顯著的核苷酸偏性選擇，由于mtDNA進(jìn)化速率較快，因此，同義取代可被認(rèn)為是線粒體系統(tǒng)在進(jìn)化速度較快的情況下保持自身蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能穩(wěn)定的一種方式[25]。另外，所有分析的Cyt b基因終止子均為不完全終止子T--，其在轉(zhuǎn)錄翻譯過程中的多聚腺苷酸化過程中，補(bǔ)齊成為完整的TAA終止密碼子[26]

表3 密碼子平均使用頻率Tab.3 Average frequence of codon usage

2.3 Cyt b基因相對(duì)遺傳距離

利用MEGA4軟件計(jì)算了鯡形目魚類相對(duì)遺傳距離（表4）。從表4可以看出，各物種之間的遺傳距離差異較大，在0.143～0.027之間。其中齒頭鯡與西鯡的遺傳距離最大（0.143），同時(shí)齒頭鯡與其他種類的遺傳距離也較大，約為0.1，表明齒頭鯡與其他物種之間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，支持齒頭鯡科在鯡形目中處于分化較早的地位。鯡科內(nèi)黍鯡與大西洋鯡遺傳距離最?。?.019），另外遠(yuǎn)東擬沙丁同大西洋鰶魚與日本銀帶鯡間遺傳距離也較小，分別為0.024和0.027。寶刀魚科同鯡科、鳀科的科間遺傳距離同鯡科內(nèi)屬間遺傳距離相當(dāng)，甚至低于個(gè)別屬間遺傳距離，并未顯示出分化差異。

表4 鯡形目魚類Cyt b基因序列遺傳距離Tab.4 Genetic distance of Clupeiformes fishes Cyt b gene

圖2 鯡形目NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 NJ phylogenetic tree of Clupeiformes

2.4 鯡形目系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

基于Cyt b基因變異構(gòu)建的NJ系統(tǒng)樹，將43個(gè)鯡形目魚類分為4個(gè)大支（圖2）。第一支為齒鯡科，第二支由鯡科多齒鰳屬和鰳屬構(gòu)成，寶刀魚科并入到鯡科中聚為第三支，最后一支為鳀科魚類組成。齒鯡科最先分化出來，為鯡形目中較為原始的類群。黃鯽、鳳鱭所在的鳀科獨(dú)立聚為一支，為單系發(fā)生，且黃鯽較鳳鱭分化更早，支持傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類結(jié)果。在鯡形目科內(nèi)分類關(guān)系層次上，孟慶聞等認(rèn)為多齒鰳屬和鰳屬魚類隸屬于鯡科鋸腹鰳亞科[9]，而NELSON則將鋸腹鰳亞科歸為獨(dú)立的一科。NJ系統(tǒng)樹表明鯡科并未能形成單系，黃鰭多齒鰳、鰳以及西非鰳，獨(dú)立于鯡科單獨(dú)聚為一支，且具較高的置信度，與LAVOUé等利用線粒體基因全序列構(gòu)建鯡形目系統(tǒng)樹所得結(jié)論一致，支持鋸腹鰳亞科提升為鋸腹鰳科[27]。在LI等[28]利用線粒體12S rRNA，16S rRNA以及RAG1與RAG2核基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，以及LAVOUé所進(jìn)行的鯡形目系統(tǒng)發(fā)育分析中，寶刀魚科寶刀魚同鯡科任氏鯡屬及銀帶鯡屬魚類親緣關(guān)系最近，與鳀科關(guān)系較遠(yuǎn)，而我們的結(jié)果則表明寶刀魚科同鯡科海鰶屬和彎耙鯡屬關(guān)系最近，但都支持寶刀魚科同鯡科較近的親緣關(guān)系，與DI[12]的形態(tài)分類學(xué)結(jié)果不一致。另外，我們?cè)贕enbank中檢索到1條只具屬名的任氏鯡屬魚類Cyt b基因序列，Jenkinsia sp.CL54，但在NJ系統(tǒng)樹中，其并未與同屬的寬帶任氏鯡聚為一支，而是獨(dú)立形成一支，提示該物種可能并非任氏鯡屬魚類。

我們的研究結(jié)果與傳統(tǒng)分類不太相符，主要為鯡科單系地位以及寶刀魚科同鯡科及鳀科親緣關(guān)系，然而鯡形目魚類眾多，只有采集更多的樣品，開發(fā)并采用多個(gè)分子遺傳標(biāo)記，基于不同的進(jìn)化模型構(gòu)建系統(tǒng)樹，并結(jié)合傳統(tǒng)形態(tài)分類結(jié)果進(jìn)行比較分析，方能得出更接近真實(shí)的鯡形目物種系統(tǒng)進(jìn)化歷史。

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