周栩 周廣東 張路 劉豫 朱吉 曹誼林

隨著定向誘導(dǎo)分化技術(shù)的逐步成熟，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）逐漸成為組織工程種子細(xì)胞的最佳來(lái)源之一，目前已經(jīng)被大量用于促進(jìn)軟骨缺損修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究，良好而有效的誘導(dǎo)方法是將BMSCs成功用于軟骨修復(fù)的關(guān)鍵[1]。地塞米松與TGF-β1、IGF-I聯(lián)合應(yīng)用，可有效地促進(jìn)BMSCs表達(dá)軟骨的特征性細(xì)胞外基質(zhì)[2-4]。雖然以BMSCs為種子細(xì)胞在體外已經(jīng)可以成功構(gòu)建出組織學(xué)結(jié)構(gòu)、生物化學(xué)組成與正常軟骨類似的組織工程化軟骨，但是體外不同誘導(dǎo)時(shí)間所構(gòu)建的軟骨的組織學(xué)特性，及相互之間的關(guān)系，仍缺乏深入研究。明確經(jīng)不同時(shí)間誘導(dǎo)的軟骨樣組織的組織學(xué)特性，對(duì)于把握組織工程組織回植體內(nèi)的最佳時(shí)機(jī)至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)以豬的BMSCs為種子細(xì)胞，在體外分別進(jìn)行成軟骨誘導(dǎo)1周和4周，并以未經(jīng)誘導(dǎo)的BMSCs和軟骨細(xì)胞為對(duì)照，分析和比較不同體外誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)BMSCs體外成軟骨分化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

長(zhǎng)楓雜交豬（n=10），1～2 月齡，6～8 Kg，雌雄不限；DMEM 培養(yǎng)液（Gibco 公司）；10%胎牛血清（Hyclone公司）；0.25%胰蛋白酶 （Sigma公司）；TGF-β1（Intergen 公司，每支 5 μg）；IGF（Intergen 公司，每支50 μg）；地塞米松（Sigma 公司，2 mg/mL）；鼠抗人Ⅱ型膠原單克隆抗體（Dako公司）；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗（Dako公司）；阿利新藍(lán)8-GX（Sigma公司）；硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma公司）；100 mm培養(yǎng)皿，0.22 μm針孔過(guò)濾器，50 mL離心管（Falcon公司）；編織聚羥基乙酸，聚乳酸，三氯甲烷（Sigma公司）； 倒置相差顯微鏡 （Nikon公司，Eclipse TS100）；精密電子天平 （Mettler Toledo公司）；DU-640紫外分光光度計(jì)（Beckman Coulter公司）；激光共聚焦顯微鏡（Leica公司，SP5）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物兩側(cè)股骨共抽取骨髓15～20 mL，分別置于兩支50 mL肝素化的無(wú)菌離心管中，加入無(wú)血清低糖DMEM培養(yǎng)液40 mL，混勻制成細(xì)胞懸液，1 500 r/min離心10 min，吸除脂肪及大部分上清液，重新振蕩混勻，以上述方法反復(fù)洗滌2次。離心后棄上清，加入10 mL含10%血清的低糖DMEM培養(yǎng)液，混勻制成細(xì)胞懸液；按6×105cells/cm2細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)皿內(nèi)。置于37℃、5%CO2、100%飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5～6 d，進(jìn)行首次換液，3～4 d后細(xì)胞達(dá)到接近融合狀態(tài)時(shí)傳代培養(yǎng)。

1.2.2 PGA支架材料的制備

非編織聚羥基乙酸/聚乳酸（PGA/PLA）60 mg，放入注射器模具中，加入少許95%乙醇，制成直徑12 mm，厚度3 mm的圓柱體。滴加0.15%的PLA-二氯甲烷溶液0.3 mL，充分晾干后放入培養(yǎng)皿中，75%乙醇浸泡1 h，紫外線照射30 min消毒，重新置入培養(yǎng)皿中，75%乙醇浸泡3次，最后1次浸泡過(guò)夜。次日用PBS洗滌2～3次后，加入含10%血清的DMEM培養(yǎng)液預(yù)培養(yǎng)過(guò)夜，次日吸干DMEM培養(yǎng)液后準(zhǔn)備接種細(xì)胞。

1.2.3 細(xì)胞-材料復(fù)合物的制備

將第 2代 BMSCs按 5×107cells/cm3接種到材料上，每塊材料接種1.2 mL細(xì)胞懸液，使之均勻分布于支架材料上，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2、100%飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～5 h后首次加培養(yǎng)液，共制作復(fù)合物10塊，隨機(jī)分組。

1.2.4 TGF－β1及 IGF-I的稀釋與保存

將TGF－β1與 IGF-I用生長(zhǎng)因子稀釋液 （含有0.1%BSA，4 mM HCl，PBS 為溶劑）稀釋，分裝后使得每個(gè) Eppendorf管內(nèi)含 1 μg 的 TGF-β1 或 5 μg的IGF-I，生長(zhǎng)因子分裝后保存于-20℃條件下，誘導(dǎo)液在換液前臨時(shí)配制。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)分組

以含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液＋0.3 g/L L-谷氨酰胺+0.05 g/L抗壞血酸+3.7g/L碳酸氫鈉+10萬(wàn)U/L青霉素鉀+0.1g/L硫酸鏈霉素為培養(yǎng)液。A組以BMSCs為種子細(xì)胞：A1組用培養(yǎng)液培養(yǎng)1周（n=1）；A2 組培養(yǎng)液培養(yǎng) 4 周 （n=1）；A3 組用培養(yǎng)液＋TGF－β1 10 ng/mL＋I(xiàn)GF-I 50 ng/mL＋地塞米松40 ng/mL， 體外誘導(dǎo)1周 （n=3）；A4組用培養(yǎng)液＋TGF－β1 10 ng/mL＋I(xiàn)GF-I 50 ng/mL＋地塞米松 40 ng/mL，體外誘導(dǎo)4周（n=3）。B組以軟骨細(xì)胞為種子細(xì)胞：B1組用培養(yǎng)液培養(yǎng)1周 （n=1）；B2組用培養(yǎng)液培養(yǎng) 4 周（n=1）。

1.3 相關(guān)檢測(cè)方法

1.3.1 細(xì)胞生長(zhǎng)情況

倒置顯微鏡下連續(xù)觀察細(xì)胞在培養(yǎng)皿中的黏附和增殖。

1.3.2 細(xì)胞－材料復(fù)合物形態(tài)學(xué)觀察

倒置相差顯微鏡及掃描電鏡下連續(xù)觀察細(xì)胞貼壁、伸展及生長(zhǎng)狀況，比較接種后細(xì)胞與材料的黏附情況，以及細(xì)胞外基質(zhì)的分泌狀況。

1.3.3 組織學(xué)和免疫組化檢測(cè)

通過(guò)HE染色、Safranin O染色和Ⅱ型膠原免疫組化，對(duì)各組細(xì)胞－材料復(fù)合物的組織學(xué)特征和GAG含量進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞生長(zhǎng)情況

BMSC原代細(xì)胞呈集落樣生長(zhǎng)，集落中央可呈復(fù)層生長(zhǎng)，細(xì)胞為紡錘形、梭形、圓形、三角形、不規(guī)則形等，核仁1～2個(gè)。傳代后可形成單層，細(xì)胞體積增大，外形似成纖維細(xì)胞，增殖迅速，有一定的方向性，細(xì)胞接近融合后呈“旋渦”樣生長(zhǎng)（圖1）。

圖1 倒置相差顯微鏡觀察BMSCs和軟骨細(xì)胞形態(tài)（40×）Fig.1 Morphology of BMSCs and chondrocytes observed by invert phase contrast microscope （40×）

2.2 細(xì)胞－材料復(fù)合物形態(tài)學(xué)觀察

接種1周時(shí)，倒置相差顯微鏡下觀察，BMSCs在PGA/PLA材料上生長(zhǎng)良好，迅速增殖并分泌ECM，分泌的ECM連成一體，散布于材料纖維之間，或形成膜狀覆蓋在纖維上；掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞與支架材料緊密黏附，形成大量的ECM。

接種4周時(shí)，鏡下看見(jiàn)支架纖維間空隙被逐漸增多的細(xì)胞及ECM所填充，整個(gè)支架透光性差（圖2）。 掃描電鏡顯示，A3、A4組較 A1、A2組具有更加豐富的基質(zhì)分泌，并且從1周到4周，細(xì)胞和支架逐漸由致密的膠原纖維和粘多糖構(gòu)成的基質(zhì)所包繞，提示我們體外一定時(shí)間的誘導(dǎo)，對(duì)于減輕材料回植體內(nèi)后引起的炎性反應(yīng)有所幫助（圖3）。

圖2 倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞與材料的黏附情況（100×）Fig.2 Adhesion of cells with scaffold observed by invert phase contrast microscope(100×)

圖3 掃描電鏡觀察細(xì)胞與材料黏附性（500×）Fig.3 Adhesion of cells with scaffold observed by scanning electric microscope(500×)

2.3 組織學(xué)檢測(cè)

2.3.1 HE染色

A1、A2、A3組均未見(jiàn)軟骨陷窩的形成。A4組和B1、B2組可見(jiàn)散在的不規(guī)則的軟骨陷窩樣結(jié)構(gòu)，并且可以見(jiàn)到散在殘留的未降解PGA纖維縱橫排列在許多陷窩之間。A4、B2組之間組織學(xué)特征較為接近，而B(niǎo)組軟骨陷窩比A組更肥大和明顯，核大位于陷窩中央。與B2比較，A4組軟骨陷窩主要存在于復(fù)合物的周邊部位，中心區(qū)結(jié)構(gòu)較松散（圖4）。

2.3.2 Safranin O染色

A、B兩組細(xì)胞-材料復(fù)合物均產(chǎn)生了富含GAG的ECM。B組復(fù)合物比A組復(fù)合物具有更強(qiáng)烈的GAG表達(dá)，在中心區(qū)域尤為明顯，而且組織中GAG的分布明顯不同。B組復(fù)合物中均含有較高水平的GAG，而A組復(fù)合物中GAG的表達(dá)主要在組織的外周區(qū)域，而且ECM表現(xiàn)出非均一性，細(xì)胞周圍缺乏高密度的ECM（圖5）。

2.3.3 Ⅱ型膠原免疫組化

各組復(fù)合物中Ⅱ型膠原的聚集和分布與aggrecan相似。A4組復(fù)合物在組織的外周區(qū)域Ⅱ型膠原高度表達(dá)，而B(niǎo)組復(fù)合物具有更加均質(zhì)和強(qiáng)烈的表達(dá)。體外GAG檢測(cè)顯示，B組和A4組均產(chǎn)生了含Ⅱ型膠原和aggrecan的軟骨細(xì)胞樣的ECM。但是，B組復(fù)合物比A組復(fù)合物具有更多的ECM分泌和更加均一的分布（圖6）。

圖4 各組標(biāo)本HE染色（200×）Fig.4 Examination of specimens in all groups by HE staining(200×)

圖5 各組標(biāo)本Safranin O染色（200×）Fig.5 Detection of Safranin O expression by immunohistochemistry staining(200×)

圖6 各組標(biāo)本Ⅱ型膠原免疫組化染色（200×）Fig.6 Detection of ColⅡexpression by immunohistochemistry staining(200×)

2.4 各組細(xì)胞材料復(fù)合物中GAG含量的改變

隨著時(shí)間延長(zhǎng)，A3、A4組和B組中GAG含量逐漸增多，其中A3組處于最低水平，B2組含量最高（圖7）。A4組中GAG含量高于A3組。方差分析顯示，A3與A4、B1與B2組之間GAG含量差異有顯著性意義（P<0.05）。

圖7 各組標(biāo)本GAG含量Fig.7 GAG content test of the specimens in all groups

3 討論

如何既控制增殖又能在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候啟動(dòng)BMSCs向所需方向分化有待進(jìn)一步的研究。根據(jù)BMSCs構(gòu)建軟骨的不同培養(yǎng)環(huán)境，分為體內(nèi)構(gòu)建和體外構(gòu)建兩種方法。體外軟骨構(gòu)建大致過(guò)程是：將體外培養(yǎng)擴(kuò)增的軟骨細(xì)胞接種在可降解支架材料上，經(jīng)體外長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)，生物材料逐漸降解，細(xì)胞不斷分泌軟骨特異性細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），最終在體外形成特定形狀的軟骨，再用于修復(fù)體內(nèi)缺損。這種方法構(gòu)建的軟骨形成和成熟過(guò)程基本上在體外完成，便于觀察和評(píng)價(jià)，而且可以分析和調(diào)控相關(guān)影響因素。更為重要的是，體外組織構(gòu)建能很好地控制預(yù)塑的軟骨形態(tài)，是未來(lái)組織工程化產(chǎn)品大規(guī)模臨床應(yīng)用的必然要求。體外構(gòu)建的主要缺點(diǎn)是對(duì)體外培養(yǎng)環(huán)境和條件要求高。明確體外軟骨構(gòu)建過(guò)程中其自身的組織學(xué)特性的變化，無(wú)疑有利于完善構(gòu)建手段，并且可以合理地決定構(gòu)建組織的體內(nèi)回植時(shí)機(jī)。

BMSCs定向分化為軟骨細(xì)胞的必要條件是具備促分化的誘導(dǎo)因子。我們的結(jié)果證實(shí)了BMSCs在體外向軟骨誘導(dǎo)1周和4周后，能夠維持初始的大小與形狀，4周的誘導(dǎo)即可以有軟骨組織產(chǎn)生，有明顯的軟骨陷窩結(jié)構(gòu)，軟骨特異性的組織化學(xué)染色呈陽(yáng)性，免疫組化染色均顯示有Ⅱ型膠原的表達(dá)，說(shuō)明4周的誘導(dǎo)時(shí)間即可以有部分細(xì)胞完成了分化的過(guò)程。體外誘導(dǎo)1周的BMSCs-材料復(fù)合物未見(jiàn)明顯的軟骨陷窩結(jié)構(gòu)，軟骨特異性的組織化學(xué)染色呈陰性。但是，體外誘導(dǎo)4周的BMSCs-材料復(fù)合物的GAG含量不及同等數(shù)量的單純軟骨細(xì)胞-材料復(fù)合物。兩種細(xì)胞形成的復(fù)合物中，細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和分布特點(diǎn)也不相同。這些結(jié)果提示，體外誘導(dǎo)時(shí)間是對(duì)BMSCs向軟骨細(xì)胞分化以及分泌軟骨細(xì)胞樣的細(xì)胞外基質(zhì)有著重要影響的因素之一。

通過(guò)體外誘導(dǎo)1周和4周，為細(xì)胞充分黏附于支架上，并且分泌細(xì)胞外基質(zhì)提供了時(shí)間。我們發(fā)現(xiàn)，雖然有些細(xì)胞從材料上流失，但大多數(shù)細(xì)胞在材料上黏附良好，分泌基質(zhì)旺盛，細(xì)胞-材料復(fù)合物形態(tài)維持良好。雖然BMSC-PGA/PLA復(fù)合物經(jīng)過(guò)體外成軟骨誘導(dǎo)4周后，分泌的軟骨細(xì)胞特異性基質(zhì)要明顯優(yōu)于在體外誘導(dǎo)1周組，但是還差于同等時(shí)間下的軟骨細(xì)胞組，說(shuō)明經(jīng)過(guò)體外4周的誘導(dǎo)，BMSCs-PGA/PLA復(fù)合物尚未形成成熟的軟骨組織。這為我們下一步將復(fù)合物回植動(dòng)物體內(nèi)提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，BMSCs在體外成軟骨誘導(dǎo)4周后，能夠維持初始的大小與形狀，可以形成軟骨陷窩樣組織結(jié)構(gòu)，與單純軟骨細(xì)胞構(gòu)建的復(fù)合物較為接近，而且GAG含量明顯高于體外誘導(dǎo)1周的細(xì)胞-材料復(fù)合物，達(dá)到了單純軟骨細(xì)胞構(gòu)建軟骨組織的60%以上。這些結(jié)果充分說(shuō)明，體外成軟骨誘導(dǎo)4周更有利于BMSCs向軟骨分化，作為陰性對(duì)照的A1、A2組未形成軟骨樣組織，表明單純BMSCs與PGA/PLA支架復(fù)合不能在體外非軟骨環(huán)境中自發(fā)形成軟骨組織。BMSCs-PGA/PLA的細(xì)胞材料復(fù)合物在體外經(jīng)成軟骨誘導(dǎo)4周后形成的細(xì)胞外基質(zhì)，還是沒(méi)有同期軟骨細(xì)胞形成的細(xì)胞外基質(zhì)成熟，提示我們尚有其他的生物化學(xué)及機(jī)械刺激的因素[6]也對(duì)BMSCs體外構(gòu)建組織工程化軟骨起著重要作用。我們相信，當(dāng)闡明了體外組織工程化軟骨在不同誘導(dǎo)時(shí)間段的組織學(xué)特性后，隨著研究的深入和方法的進(jìn)一步優(yōu)化，最終可在體外構(gòu)建出具有優(yōu)良軟骨性能的、能大規(guī)模生產(chǎn)的組織工程化軟骨組織。

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