劉春蓮 ，景萬(wàn)紅，彭 亮，焦海燕，徐 仙

(1寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，銀川750004;2寧夏回族自治區(qū)生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;3寧夏醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)教研室)

15% ～25%的育齡夫婦患有不育癥，而男性因素占將近50%，其中無(wú)精子癥占10% ～20%［1］。精子的產(chǎn)生受遺傳基因的調(diào)控和內(nèi)分泌激素的調(diào)節(jié)。2009年9月～2010年7月，我們觀察了96例無(wú)精子癥患者的異常染色體核型及Y染色體微缺失情況，并探討其診斷方法。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1．1 臨床資料 96例無(wú)精子癥患者(觀察組)來(lái)自寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，年齡19～39歲;連續(xù)2次精液分析并經(jīng)離心沉淀均未發(fā)現(xiàn)精子;通過(guò)臨床檢查排除生殖道梗阻、精索靜脈曲張等。40例已生育過(guò)的男性體檢者為對(duì)照組，年齡23～40歲。抽取研究對(duì)象的外周血進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)及Y染色體微缺失檢查;其中42例無(wú)精子癥患者(一側(cè)睪丸體積≥8 ml，外周血染色體檢測(cè)正常)行經(jīng)皮附睪穿刺精子抽吸術(shù)(PESA)或PESA聯(lián)合經(jīng)皮睪丸穿刺精子抽吸術(shù)(TESA)。

1．2 方法

1．2．1 常規(guī)檢查 ①睪丸體積測(cè)定:采用Prader睪丸模型比擬法測(cè)定睪丸體積。②血清性激素檢測(cè):于上午9:00～10:00空腹抽取受檢者外周靜脈血3 ml，放射免疫法檢測(cè)血清促卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)、催乳素(PRL)、睪酮(T)和雌二醇(E2)。

1．2．2 染色體核型分析 取受檢者外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)，制備染色體標(biāo)本，吉姆薩染色，顯微鏡下觀察。每例計(jì)數(shù)30個(gè)分裂相，G顯帶分析3～5個(gè)核型，結(jié)果分析按照人類細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制進(jìn)行。

1．2．3 Y染色體AZF因子檢測(cè) ①DNA的提取:抽取受檢者外周血3 ml，EDTA抗凝。按照全血細(xì)胞DNA提取試劑盒說(shuō)明提取DNA，－20℃保存。②Y染色體AZF因子檢測(cè):采用Y染色體微缺失檢測(cè)試劑盒，根據(jù)歐洲男科協(xié)會(huì)(EAA)檢測(cè)指南推薦方法進(jìn)行PCR。每個(gè)AZF區(qū)域設(shè)置2個(gè)序列標(biāo)簽位點(diǎn)(STS):AZFa為SY84、SY86;AZFb為SY127、SY134;AZFc為SY254、SY255。所有DNA樣品均經(jīng)2次多重PCR完成，稱為Multiplex A和B，每次多重PCR均包括 AZFa、b、c區(qū)域的 STS和對(duì)照基因引物。PCR產(chǎn)物8 μl經(jīng)3．0%瓊脂糖凝膠電泳40 min，用Gel Doc2000凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行DNA電泳條帶的觀察。

1．2．4 PESA和TESA檢查 觀察組選擇睪丸體積較大一側(cè)先行PESA。顯微鏡下觀察抽取的附睪液，對(duì)精子進(jìn)行計(jì)數(shù)。若鏡檢有精子，結(jié)束操作;若無(wú)精子，行對(duì)側(cè)PESA;若對(duì)側(cè)PESA仍無(wú)精子，則選擇睪丸體積較大一側(cè)行TESA，對(duì)抽吸得到的睪丸組織進(jìn)行鏡檢分析。

1．2．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11．0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料如為偏態(tài)分布則用秩和檢驗(yàn)，如為正態(tài)分布則用t檢驗(yàn)。P≤0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 染色體核型檢測(cè)結(jié)果 觀察組檢出染色體核型異常者27例(占28．1%)，染色體核型分別為47，XXY 9 例、46，XY(大 Y)6 例、47，XYY 1 例、46，XY(小 Y)9例、46，XY(或47，XYY，－9+)2 例。對(duì)照組檢出染色體核型異常者2例，染色體核型分別為46，XY(大 Y)、46，XY(小 Y)。

2．2 AZF檢測(cè)結(jié)果 觀察組共檢出AZF微缺失7例(占7．29%)，其中AZFc缺失5例、AZFb+c缺失1例、AZFa+b+c缺失1例。對(duì)照組未檢測(cè)到AZF缺失。

2．3 PESA、TESA檢查結(jié)果 觀察組42例患者接受PESA，其中26例顯微鏡下可見(jiàn)精子，診斷為梗阻性無(wú)精子癥(OA組)，精子處理后冷凍保存?zhèn)溆?余16例再行TESA，解剖鏡下未見(jiàn)精子，組織病理學(xué)檢查證實(shí)無(wú)精子，診斷為非梗阻性無(wú)精子癥(NOA組)。

2．4 睪丸體積和血清性激素檢測(cè)結(jié)果 OA組和NOA 組睪丸體積分別為(14．92 ±2．78)、(11．25 ±2．76)ml，兩組相比，P ＜ 0．01。兩組血清性激素水平比較見(jiàn)表1。

表1 OA組和NOA組血清性激素水平比較(±s)

表1 OA組和NOA組血清性激素水平比較(±s)

注:與 OA 組相比，*P ＜0．01

組別 FSH(mIU/ml) LH(mIU/ml) PRL(ng/ml) T(ng/ml) E2(pg/ml)OA 組 3．92 ±2．43 3．44 ±1．74 9．41 ±3．85 4．175 ±2．265 40．95 ±24．28 NOA 組 12．99 ±6．12* 6．31 ±2．14* 10．23 ±4．29 3．747 ±2．481*29．53 ±10．95

3 討論

文獻(xiàn)報(bào)道，無(wú)精子癥患者染色體異常頻率為13．7% ～25．5%［2］，本研究中觀察組為 28．1%。染色體核型異常者均為性染色體異常，異常類型主要有 Klinefehers syndrome(47，XXY)、大 Y(Y≥18)和小Y(Y≤21)。大Y和小Y通常被認(rèn)為是染色體多態(tài)性變異，一般不會(huì)引起有害的遺傳學(xué)性狀。但是近來(lái)的研究表明［3］，染色體多態(tài)性與生殖異常如男性不育、精子異常等有關(guān)。

Y染色體長(zhǎng)臂AZF微缺失也被認(rèn)為是引起男性生精障礙的一個(gè)常見(jiàn)的遺傳因素［4］。有關(guān)Y染色體微缺失頻率各地區(qū)報(bào)道不盡相同，本資料為7．29%。有學(xué)者等［5］認(rèn)為，AZFa缺失表現(xiàn)為惟一支持細(xì)胞綜合征的證據(jù)，并伴有睪丸體積縮小;AZFb缺失表現(xiàn)為精子成熟障礙，主要停留在精母細(xì)胞階段。Imken等［6］研究表明，AZFc缺失患者的睪丸病理表現(xiàn)從正常到無(wú)精子。本研究接受TESA的42例無(wú)精子癥患者中，發(fā)現(xiàn)AZFc位點(diǎn)SY254/255突變1例、AZFc位點(diǎn)SY254/242/255/239和AZFb位點(diǎn)SY254/152突變1例;1例AZFb+c缺失者病理診斷為精子成熟停滯;1例AZFc缺失者病理診斷見(jiàn)成熟正常精子。Oates等［7］報(bào)道，Y染色體AZFc微缺失患者，通過(guò)輔助生殖技術(shù)妊娠的成功病例。本研究中1例AZFc缺失患者接受單精子卵胞漿內(nèi)顯微注射技術(shù)(ICSI)，成功臨床妊娠，目前尚在孕期。Y染色體AZF微缺失的頻率、位置及程度有所不同，可能與種族、地區(qū)性差異、遺傳多態(tài)現(xiàn)象有關(guān)。所以在不同地區(qū)進(jìn)行Y染色體AZF微缺失的檢測(cè)具有重要的實(shí)際意義。本研究中9例Y染色體微缺失患者中有5例伴有AZF微缺失，兩者有一致性。進(jìn)一步證實(shí)男性不育與染色體異常和Y染色體微缺失密切相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，睪丸病理檢查為無(wú)精子癥的患者睪丸體積明顯縮小，可能由于下丘腦、垂體及睪丸疾病引起，睪丸生精功能受損;無(wú)精子組血清FSH、LH均升高，T水平降低，而PRL、E2水平無(wú)明顯變化，其原因可能是各種病因致睪丸組織受到損傷，曲細(xì)精管上皮廣泛玻璃樣變化和纖維化，使曲細(xì)精管分泌的某種抑制垂體FSH、LH分泌的因子減少，同時(shí)影響了睪酮的合成分泌。根據(jù)無(wú)精子癥患者的病史，結(jié)合睪丸體積，進(jìn)行遺傳學(xué)相關(guān)檢查和血清性激素水平檢測(cè)，可以對(duì)無(wú)精子癥患者的病情做出較為準(zhǔn)確的評(píng)估，從而對(duì)癥治療，減少不必要的手術(shù)，并可確認(rèn)是否有治療價(jià)值及是否采用內(nèi)分泌治療。

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