鄭 楊 安 平 于水瀾

黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)（黑龍江哈爾濱150000）

益腎活血法是治療慢性腎衰竭（CRF）的常用方法，前期研究表明該法能延緩CRF的發(fā)展［1］。為探討益腎活血法延緩CRF的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)觀察益腎活血法對(duì)CRF大鼠腎組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β1（TGF-β1）、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）蛋白表達(dá)的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性wistar大鼠60只，體質(zhì)量200～220g。黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物益腎活血復(fù)方：由黑龍江省中醫(yī)研究院提供，常規(guī)煎煮，將濾液濃縮為2g/mL；尿毒清顆粒：廣州康臣藥業(yè)有限公司，批號(hào)Z10970122。腺嘌呤，美國(guó)AMRESCO公司，批號(hào)0272B31。兔抗大鼠TGF-β1、CTGF多克隆抗體，武漢博士德生物工程公司提供；二步法免疫組化檢測(cè)試劑，北京中山生物技術(shù)有限公司提供。

1.3 造模與給藥60只大鼠隨機(jī)分為5組，每組12只。即正常組、模型組、尿毒清組、益腎活血法低劑量治療組（低劑量組）、益腎活血法高劑量治療組 （高劑量組）。除正常組外，其余各組予2.5%腺嘌呤 250mg/（kg·d）灌胃，正常組給予等量蒸餾水，連續(xù)21d。造模結(jié)束后，低劑量組按3.77g/（kg·d）灌胃，高劑量組按11.3g/（kg·d）灌胃，尿毒清組按 1.81g/（kg·d）灌胃。 正常組、模型組給予等體積蒸餾水灌胃，治療50d，治療過程中大鼠死亡5只。

1.4 標(biāo)本采集與檢測(cè)大鼠禁食、水24h后脫頸處死，剖取雙腎投入4%多聚甲醛固定。采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腎臟TGF-β1、CTGF蛋白表達(dá)；根據(jù)每張切片陽性反應(yīng)顆粒的顏色和細(xì)胞總數(shù)的比例擬訂標(biāo)準(zhǔn)。陰性（－）：偶見陽性顆粒，顏色淺黃。弱陽性（+）：陽性顆粒少于1/3，顏色呈淡棕黃。陽性（++）：陽性顆粒介于 1/3～2/3 之間，顏色介于+～+++間。 強(qiáng)陽性（+++）：陽性顆粒大于2/3，顏色棕褐。對(duì)結(jié)果進(jìn)行定量統(tǒng)計(jì)，并賦分，（-）：1分；（+）：2 分；（++）：3 分；（+++）：4 分。 每張切片觀察 3 個(gè)視野。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理等級(jí)資料用Ridit分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 益腎活血法對(duì)大鼠腎組織TGF-β1的影響見表1。模型組TGF-β1表達(dá)陽性積分明顯高于正常組和高劑量組，兩組與模型組比較有極顯著差異（P<0.01）。高劑量組陽性表達(dá)與尿毒清組比較有顯著差異（P<0.05）。

2.2 益腎活血法對(duì)大鼠腎組織CTGF的影響見表2。模型組CTGF表達(dá)陽性積分明顯高于正常組和益腎活血法高劑量組，兩組與模型組比較有極顯著差異（P<0.01）。高劑量組陽性表達(dá)與尿毒清組比較有顯著差異（P<0.05）。

表1 各組大鼠腎組織TGF-β1表達(dá)比較 （n）

表2 各組大鼠腎組織CTGF表達(dá)比較 （n）

3 討 論

腎間質(zhì)纖維化的形成主要為腎小管上皮細(xì)胞損傷后的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失調(diào)導(dǎo)致的惡性循環(huán)，其中TGF-β1、CTGF是最重要的質(zhì)纖維化的因子之一。TGF-β1主要分布在腎小管間質(zhì)，具有促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)增生，膠原分泌，對(duì)成纖維細(xì)胞有趨化作用，激活腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞并使其增殖。CTGF在TGF-β1的誘導(dǎo)下，參與間質(zhì)成纖維細(xì)胞的增生、移動(dòng)、黏附，腎小管上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的過量合成，導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化。

HE染色結(jié)果證實(shí)［1］，模型組腎小管萎縮，間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)增寬，說明腎間質(zhì)纖維組織明顯增生。益腎活血法高劑量組腎小管萎縮、間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、間質(zhì)增寬較模型組明顯減輕。免疫組化證實(shí)，模型組腎間質(zhì)中TGF-β1、CTGF蛋白表達(dá)明顯增多，用益腎活血法高劑量治療后腎間質(zhì)纖維組織增生明顯減少，TGF-β1、CTGF蛋白的表達(dá)減弱。說明益腎活血的作用機(jī)制可能通過降低TGF-β1表達(dá)，進(jìn)而降低CTGF表達(dá)；或者通過抑制降低CTGFA表達(dá)，抑制a-SMA轉(zhuǎn)化成 MyoFB，進(jìn)而抑制腎小管間質(zhì)細(xì)胞分裂增殖，膠原合成減少，延緩腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程。

慢性腎衰竭以脾腎陽氣虛衰為本，濕濁、瘀血為其標(biāo)，益腎活血復(fù)方針對(duì)此病機(jī)，以補(bǔ)腎活血為主，兼以化濁解毒。方中黃芪補(bǔ)氣，巴戟天等滋腎助陽；桃仁、紅花、丹參等活血化瘀，當(dāng)歸養(yǎng)血活血，黃連、大黃解毒，蒼術(shù)溫化濕濁，諸藥合用標(biāo)本兼治。

［1］鄭楊，張浩，李淑菊，等.益腎活血法延緩慢性腎衰竭的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中醫(yī)藥信息，2005，22（6）：56-57.