李 慧 ,田黎明 ,徐王月王月 ,蘇雪瑩

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154003)

白血病是造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病,與多發(fā)性骨髓瘤和淋巴瘤共同組成血液系統(tǒng)三大惡性腫瘤,發(fā)病率為2.76/10萬,與亞洲國家相近,稍低于歐洲國家水平。在惡性腫瘤死亡率中 ,白血病居第6位 (男性 )和第8位(女性),在兒童及35歲以下成人中則居第1位。其重要生物學(xué)特征是白血病細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。所以近幾年尋找能反映白血病細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的標(biāo)記物成為研究的熱點(diǎn)。肝細(xì)胞生長因子(HGF)來源于間質(zhì)細(xì)胞,其受體是原癌基因 C-met的產(chǎn)物。HGF是組織細(xì)胞分泌的含728個(gè)氨基酸的無活性的單鏈前體蛋白經(jīng)胰蛋白酶樣水解酶作用裂解成有活性的二聚體即肝素結(jié)合糖蛋白[1]。研究證明 HGF/C-met不僅參與調(diào)節(jié)正常細(xì)胞粘附、分化和遷移,也參與其惡性轉(zhuǎn)化?；|(zhì)金屬蛋白酶(MM Ps)家族在正常骨髓中通過調(diào)整骨髓細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的生長增殖分化粘附和遷移等[2],是目前已知的唯一能夠降解膠原纖維的酶類。由于他們對細(xì)胞外基質(zhì)的降解,從而更利于腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。其家族成員MM P-7更是在腫瘤細(xì)胞的凋亡中起了重要的作用。本實(shí)驗(yàn)中,我們用酶聯(lián)免疫法檢測 HGF和 MM P-7在白血病中的表達(dá)及研究它們的相關(guān)性。從而探討它們與白血病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

50例白血病患者外周血均取自 2010— 05～ 2011— 09佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科,其中男 21例,女29例,年齡18～ 79歲,中位年齡48.5歲。白血病患者中初治 31例,復(fù)發(fā)19例。50例白血病患者均經(jīng)療程的化療治療后依據(jù)其骨髓細(xì)胞學(xué)分析分為 CR28例和 PR22例。白血病患者診斷標(biāo)準(zhǔn)參照張之南主編 《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)(第 3版)》,40例對照組標(biāo)本取自同期佳木斯大學(xué)第一附屬醫(yī)院生化實(shí)驗(yàn)室。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

所有標(biāo)本均經(jīng)室溫下放置 2h后于 1000g離心20min,取上清液,將標(biāo)本放置于-20℃保存。用酶聯(lián)免疫方法檢測MM P-7和 HGF在白血病患者外周血中的表達(dá)用純化的抗體包被微板孔,制成固相載體,依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的抗 MM P-7(或 HGF)抗體、HRP標(biāo)記的親和素、經(jīng)徹底洗滌后用底物 TM B顯色。試劑盒購自天津索羅門生物科技有限公司。

1.3 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

TM B在經(jīng)過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成黃色。顏色深淺與標(biāo)本中 (HGF或 MM P-7)的量成正相關(guān)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)資料進(jìn)行 t檢驗(yàn)及 Spearman相關(guān)分析,α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 MM P-7在白血病外周血清中的表達(dá)

白血病患者外周血中 HGF與 MM P-7的表達(dá)明顯高于對照組 (P＜0.05)。白血病組中,AM L與 ALL中的表達(dá)無顯著差異性 (P＞ 0.05);AM L與 CM L中的表達(dá)無顯著差異性 (P＞ 0.05);ALL與 CM L中的表達(dá)無顯著差異性(P ＞ 0.05)。見表1。

表1 HGF及 MMP-7在各型白血病組及對照組中的表達(dá) ±s)

表1 HGF及 MMP-7在各型白血病組及對照組中的表達(dá) ±s)

#P＜0.05,compared with the control group

2.2 MMP-7與 HGF在白血病患者外周血中的表達(dá)相關(guān)性分析

HGF與 MM P-7在白血病患者外周血清中的表達(dá)呈正相關(guān) (r= 0.303,P＜0.05),且二者關(guān)系程度較密切。

2.3 HGF與 MM P-7在初治組與復(fù)發(fā)組中的表達(dá)

白血病患者初治組與復(fù)發(fā)組患者外周血中 HGF與MM P-7的表達(dá)差異不顯著,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞ 0.05)。見表2。

表2 HGF及 MMP-7初治組及復(fù)發(fā)組中的表達(dá) ±s)

表2 HGF及 MMP-7初治組及復(fù)發(fā)組中的表達(dá) ±s)

2.4 CR組與 PR組的比較

MM P-7與 HGF在白血病 CR組中的表達(dá)水平高于 PR組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P ＜0.05)。(見表3)

表3 HGF及 MMP-7在 CR組及 PR組中的表達(dá) ±s)

表3 HGF及 MMP-7在 CR組及 PR組中的表達(dá) ±s)

3 討論

本研究測定了白血病患者外周血清中 MMP-7和 HGF的水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,白血病患者血清中 HGF和 MM P-7的水平均明顯高于對照組且 CR組 MM P-7和 HGF的表達(dá)水平明顯低于 PR組,差異具有顯著性。根據(jù) Liotta曾提出腫瘤轉(zhuǎn)移的“三步驟”假說[3],惡性腫瘤細(xì)胞要想發(fā)生、發(fā)展、侵襲與轉(zhuǎn)移所必須要攻克的屏障即是基底膜與細(xì)胞外基質(zhì)。MM Ps是骨髓微環(huán)境的重要組成部分,在正常的生理?xiàng)l件下以酶原的形式直接分泌到細(xì)胞外基質(zhì),通過對除多糖外的大多數(shù)細(xì)胞外基質(zhì)的降解而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對周圍組織的浸潤[4]。另外,MM P-7通過作用于多種刺激信號而啟動凋亡程序發(fā)揮抗凋亡作用,其如 Fas程序。腫瘤細(xì)胞或正常細(xì)胞表面的跨膜 Fas配體(mFasl)通過與 MM P-7作用而產(chǎn)生可溶性 Fas配體(sFasl)保護(hù)腫瘤細(xì)胞逃避由 fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程[5]。在許多實(shí)體瘤中,MMP-7蛋白的高表達(dá)與惡性腫瘤化療療效相關(guān)[6]。其機(jī)制可能與 MMp-7的抗凋亡作用有關(guān)。同時(shí) MMP-7缺少基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(TIM P)在 MM Ps家族的作用靶點(diǎn) C末端區(qū)域,所以目前對MM P-7的抑制劑正有待研究。所以認(rèn)為 MM P-7在白血病中的作用機(jī)制、發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移乃至白血病患者的治療上都有較廣闊的研究空間。HGF通過分解 IV型膠原、破壞基底膜,然后穿過內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入血管內(nèi),從而增強(qiáng)癌細(xì)胞的運(yùn)動能力,加速癌細(xì)胞的血管內(nèi)游走和惡性腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[7]。Pepper[8]認(rèn)為 HGF主要是上調(diào)尿激酶及受體的基因表達(dá)水平,導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生過多的尿激酶,引起細(xì)胞外基質(zhì)的(ECM)局灶性降解,有利于細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移。另外 HGF在促進(jìn)腫瘤血管的發(fā)生中起到了積極地作用:HGF與內(nèi)皮細(xì)胞表面受體 c-Met結(jié)合可激活受體酪氨酸激酶,使β亞基磷酸化,直接誘導(dǎo)血管內(nèi)皮的增殖及遷移,同時(shí)參與血管內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)。除此之外,HGF增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞在模擬血管生成的胞外微環(huán)境(如三維膠原)中管狀結(jié)構(gòu)形成的能力。

MM P-7和 HGF分別通過各自的方式直接或間接參與了腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移。且共同降解細(xì)胞外基質(zhì)。HGF和其特異性受體 c-met通過特有的信號傳導(dǎo)途徑促進(jìn) MMP的表達(dá)。Morishita[9]等研究發(fā)現(xiàn),HGF在體外誘導(dǎo)人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞和冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞 M T1-MM P的生成,同時(shí)可以激活 MMP-2的活性。MM P-7由于其能夠抑制腫瘤細(xì)胞凋亡,激活其他 MM P成員(MM P-2,MMp-9等 )和滅活 serpins(絲氨酸蛋白酶抑制劑),而被認(rèn)為與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移直接相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)研究表明 MM P-7與 HGF在白血病患者外周血中的表達(dá)呈正相關(guān),所以我們推測白血病患者外周血中 HGF與 mmp-7之間存在一種必然聯(lián)系共同作用于白血病細(xì)胞而促進(jìn)其增殖及浸潤,二者之間具體的作用機(jī)制需要更進(jìn)一步的研究。HGF及 MM P-7在白血病患者中的測定有望成為白血病的早期診斷及治療提供新的理論依據(jù)及治療新靶點(diǎn)。

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