陜西省婦幼保健院產(chǎn)三科 (西安 710004)董莉潔 曹引麗

妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥(ICP)可導(dǎo)致早產(chǎn)、新生兒窒息、圍產(chǎn)兒死亡、新生兒神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥等[1]。胎兒宮內(nèi)病死率可達(dá) 2%。更有研究指出 ,不明原因的死胎、死產(chǎn)中有半數(shù)是由 ICP引起的[2]。近年來一系列研究表明[3]膽汁酸對(duì)未成熟心肌細(xì)胞有明確的毒性作用 ,可能是 ICP時(shí)胎兒心肌損傷的重要原因。本次實(shí)驗(yàn)擬通過制備 ICP動(dòng)物模型檢測(cè)孕鼠血清中的心肌酶譜的變化,觀察不同程度 ICP胎鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的病理改變及線粒體氧化應(yīng)激,研究 ICP胎鼠心肌損傷機(jī)制,并進(jìn)一步探討 ICP孕婦胎兒猝死的原因。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)用清潔級(jí) SD雌性大鼠(由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),體重 200～ 220g,年齡 150～ 170d;室溫 18～ 20℃,相對(duì)濕度 40%～ 70%;不限制飲水和飲食;于發(fā)情期與雄性 SD大鼠 1∶1合籠飼養(yǎng),每天觀察糞盤內(nèi)有無脫落的陰栓蠟塊,陰栓脫落日定為妊娠第 1天,分籠飼養(yǎng)待用。主要試劑為苯甲酸雌二醇(2 mg/ml),

2 方 法

2.1 動(dòng)物模型制備:依據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)及臨床研究結(jié)果[4,5],取孕 14d SD大鼠 60只,隨機(jī)分為對(duì)照組和高、低雌激素組,每組 20只,分別在后肢內(nèi)側(cè) 3ml/(kg?d)的生理鹽水,1次 /d及皮下注射劑量為 5.0(高劑量 )1.2.mg/(kg? d)(低劑量)苯甲酸雌二醇連續(xù) 5d,孕 20d以氯安酮 120g/kg麻醉孕鼠剖宮取胎,收集一窩胎鼠,留取胎心待測(cè)。

附表 胎鼠血清生化指標(biāo)和心肌酶譜變化情況

圖1 胎鼠心肌病理結(jié)構(gòu) HE染色結(jié)果(左:高濃度組 200×;右:對(duì)照組 200×)

2.2 標(biāo)本的采集及處理:每組孕鼠于孕 14d建模 前及 20d(120mg/kg氯胺酮麻醉后)剖宮產(chǎn)前從眶靜脈采取全血 2ml室溫下靜置 3min,離心 10min后取血清 1ml檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。同時(shí)剖開子宮,收集一窩胎鼠,逐個(gè)稱重,提取心肌及線粒體,檢測(cè)線粒體活性氧簇。

結(jié) 果

1 胎鼠血清生化指標(biāo)和心肌酶譜的變化,見附表。

2 心肌病理結(jié)構(gòu)及對(duì)線粒體活性氧簇的改變。

2.1 胎鼠心肌病理結(jié)構(gòu) HE染色結(jié)果,見圖 1。結(jié)果表明,高濃度組胎鼠心肌細(xì)胞萎縮,體積縮小,胞漿染色淺淡,形狀不規(guī),細(xì)胞間隙顯著增寬,被脂肪充填,胞漿內(nèi)可見較多嗜酸性顆粒沉積,局部胞漿溶解、核消失;低濃度及對(duì)照組心肌細(xì)胞病理無明顯改變。

2.2 MXC對(duì)活性氧簇生成的影響,見圖 2。結(jié)果表明與對(duì)照組相比較,5.0 mg/(kg? d)組較對(duì)照及 2.5 mg/(kg? d)組活性氧水平明顯增加(P＜0.05)。

圖2 各劑量組 ROS水平占對(duì)照組的百分比

討 論

ICP顯著的生化改變是母體循環(huán)、胎兒循環(huán)及羊水高膽汁酸水平。Williamson、Gorelik和 Yang[6～8]人通過一系列研究發(fā)現(xiàn),將心肌細(xì)胞暴露于高濃度?；悄懰?＞0.3mmo1/L)一定時(shí)間 ,新生大鼠心肌細(xì)胞出現(xiàn)持久性的損傷,而成年大鼠心肌細(xì)胞的損傷具有可逆性,表明膽汁酸對(duì)心臟有直接毒性作用,并提示胎兒心肌細(xì)胞較成人心肌細(xì)胞對(duì)膽酸的毒性作用更為敏感。心肌損傷或者壞死后心肌酶有不同程度的釋放到血清中,其中 CK,LDH1特異性最高,檢查心肌酶主要是確定心肌缺血壞死或細(xì)胞膜的通透性。

細(xì)胞的活性氧簇 (ROS)(主要為 H2O2、O2-、 OH-),不能被及時(shí)清除時(shí),便發(fā)生氧化應(yīng)激,對(duì)整個(gè)器官產(chǎn)生影響,若持續(xù)存在則導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。目前認(rèn)為 ROS的檢測(cè)中線粒體是首選的、最好的方法,其出現(xiàn)最早。主要來源是呼吸鏈產(chǎn)生的活性氧簇,還有線粒體體膜通透性改變誘導(dǎo)線粒體發(fā)生的氧化應(yīng)激。當(dāng)各種原因?qū)е戮€粒體內(nèi)膜去極化,跨膜電勢(shì)降低,都會(huì)使 ROS產(chǎn)生增加,ROS增加后,其會(huì)導(dǎo)致線粒體膜電位下降、開放膜通透性轉(zhuǎn)換孔,細(xì)胞色素 C的釋放增加,通過激活Caspase級(jí)聯(lián)途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

本次實(shí)驗(yàn)成功建立妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積模型,結(jié)果表明高 E量組的胎鼠胚胎成活率、21日胎體重均明顯低于低 E量組及對(duì)照組胎鼠,高 E量組較低 E量組、對(duì)照組總膽酸與肌酸激酶同工酶顯著升高。病理切片,心肌細(xì)胞中觀察到明顯的心肌萎縮病理結(jié)果改變,伴有心肌損害。本研究觀察到高劑量組 ROS水平明顯升高,由此推測(cè),高濃度膽汁酸通過改變了心肌線粒體膜的通透性,引起了跨膜電位的降低,造成心肌損害。

綜上,高濃度膽汁酸可能通過誘導(dǎo)心肌組織線粒體發(fā)生氧化應(yīng)激,從而發(fā)揮其促進(jìn)心肌細(xì)胞缺血缺氧性損傷、凋亡的毒性作用,據(jù)此推測(cè),這可能是造成胎兒宮內(nèi)猝死的原因。

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