李 榮 李 蓉 西安市第五醫(yī)院內(nèi)三科 (西安 710082)

苦參黃芪湯具有活血化瘀,兼以扶正、益氣、清熱解毒、利濕退黃等作用,在臨床應(yīng)用多年,能有效治療肝炎及肝硬化早期患者,但機(jī)理不明。本實(shí)驗(yàn)為探討此中藥方劑抗大鼠肝纖維化作用的機(jī)制,做了以下研究。

1 材料和方法 1.1 藥物和主要試劑 苦參黃芪湯由黃芪 30g,雞血藤 15g,黃芩、苦參各 10g組成,由西安中藥廠制成粉劑。其中每克粉劑含生藥 2g。兔抗鼠 TGF-β1多克隆抗體、PDGF-BB及 CTGF多克隆抗體購自武漢博士德生物公司。免疫組化 ElivisionTM Plus廣譜試制盒購自福建邁新公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組與處理 清潔劑雄性 Wistar大鼠 60只,購自第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,平均為 180 g。隨機(jī)分為 4組:正常對照組(15只),除正常飲食、飲水外,每日給予 0.9%氯化鈉灌胃,皮下注射花生油,量同模型組;模型組(15只),按《中藥藥物實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》用復(fù)合因素造模[1],實(shí)驗(yàn)第 1天皮下注射40%CCl4花生油溶液 0.5mL/100g體重,以后每隔 3d,皮下注射 40%CCl4花生油溶液 0.3mL/100g體重,以 79.5%單純面粉、20%豬油及 0.5%膽固醇配成混合飼料,自來水為唯一飲料飼養(yǎng)動(dòng)物。10周后處死大鼠,分別取心臟血及收集肝臟標(biāo)本;中藥組(30只),造模方法同上,造模的同時(shí)給予中藥灌胃。中藥組分為大、小劑量組,每組 15只,大劑量組:每日給中藥粉劑量 2 g/100 g體重;小劑量組:每日給予中藥 0.5 g/100 g。以上2組,每日用藥 1次,共 10周。 10周后處理同上。

1.3 檢測方法 取大鼠心臟血由同位素科專人用放射免疫法測定大鼠血清中肝纖維化指標(biāo) PCⅢ、CIV、HA、LN的含量。各組大鼠肝組織標(biāo)本行 M ASSON三色染色,光鏡下觀察。由同一病理醫(yī)生予以纖維化分級(jí)并行定量分析。肝纖維化分期標(biāo)準(zhǔn)[2]。 0期:無膠原纖維形成;1期:匯管區(qū)擴(kuò)大,顯微組織將匯管區(qū)相連;2期:匯管區(qū)周圍纖維化,纖維間隔形成,小葉結(jié)構(gòu)保留;3期:匯管區(qū)與中央靜脈之間出現(xiàn)廣泛的纖維相連;4期:假小葉形成。應(yīng)用免疫組化法觀察 TGF-β1、CTGF、PDGFBB在肝細(xì)胞的著色情況,應(yīng)用 Q550010型圖像采集與分析系統(tǒng),對各組切片隨機(jī)選取 10個(gè)視野,在 20倍物鏡下測量陰性細(xì)胞面積占肝臟視野面積的比,進(jìn)行定量分析。

2 結(jié) 果 2.1 各組大鼠血清纖維化指標(biāo)的比較 見表 1。

表1 各組大鼠血清肝纖維化指標(biāo)變化比較(±s)單位:(g/L)

表1 各組大鼠血清肝纖維化指標(biāo)變化比較(±s)單位:(g/L)

注:△與正常對照組比較 P＜0.05,▲與模型組比較 P＜0.05

組 別 n PCⅢ CⅣ HA LN正常對照組 15 13.2± 1.12 4.90± 0.62 104.36± 25.3 27.46± 6.56模型組△ 15 40.01± 0.52 20.56± 0.23 315.20± 98.39 70.11± 10.02小劑量組△▲ 15 34.20± 0.82 14.52± 0.42 185.20(18.21 59.54± 7.58大劑量組△▲ 15 19.56± 0.98 7.98± 0.91 137.25± 19.89 48.59± 9.82

與正常對照組相比,中藥各組和模型組的血清肝纖維化指標(biāo)均明顯升高(P＜0.05);與模型組相比,中藥各組肝纖維化指標(biāo)明顯降低(P＜0.05);不同劑量的中藥各組比較,大劑量組優(yōu)于小劑量組(P ＜0.05)。

2.2 光鏡下組織形態(tài)學(xué)改變 見表 2。

表2 各組大鼠纖維化增生程度的比較

表3 各組大鼠纖維化定量分析結(jié)果(±s)單位:(m2/(m2× 100%

表3 各組大鼠纖維化定量分析結(jié)果(±s)單位:(m2/(m2× 100%

注:膠原面密度=膠原面積/肝組織視野面積×100%,△與正常對照組比較(P＜0.05)▲與模型組比較(P＜0.05)

組 別 n 膠原面密度正常對照組 15 4.83±2.78模型組 15 24.31± 3.55△小劑量組 15 18.02± 3.64△▲大劑量組 15 7.97± 1.06△▲

2.3 結(jié)果顯示:與正常對照組相比,中藥各組及模型組的膠原面密度明顯增加(P＜0.05);與模型組相比,中藥各組的膠原面密度明顯下降,大劑量組優(yōu)于小劑量組(P ＜0.05)。

2.4 各組大鼠肝組織中 TGF-B1、CTGF、PDGF-BB表達(dá)的比較,見表 4。

表4 各組大鼠肝組織中 TGF-B1、CTGF、PDGF-BB表達(dá)的比較(±s)um2/um2

表4 各組大鼠肝組織中 TGF-B1、CTGF、PDGF-BB表達(dá)的比較(±s)um2/um2

注:△與正常對照組比較(P＜0.05)▲與模型組比較(P＜0.05)

組 別 nTGF-β1CTGF PDGF-BB模型 組 15 0.61± 0.05 0.80± 0.02 0.61± 0.06△中藥小劑量組 15 0.30±0.08 0.11± 0.05 0.41± 0.10△▲中藥大劑量組 15 0.13±0.08 0.05± 0.09 0.18± 0.01△▲正常對照組 15 0.10±0.02 0.03±0.01 0.05±0.02

討 論 現(xiàn)已證明,肝纖維化 (Hepatic fibrosis)是由各種原因造成肝細(xì)胞受損,使肝細(xì)胞外機(jī)制合成增多而降解減少,導(dǎo)致大量的纖維組織增生,最后發(fā)展為肝硬化。肝纖維化是各種慢性肝病發(fā)展為肝硬化的共同病理過程[3]。目前中醫(yī)中藥治療肝纖維化,多從慢性肝炎及肝硬化的整體著手,以病機(jī)為基礎(chǔ),辨證施治。慢性肝病系因病既久,乘脾犯胃及腎,致肝、脾、腎俱損,氣、血、水搏結(jié),其關(guān)鍵在于肝脾血瘀。因此治則多以活血化瘀為基礎(chǔ),兼顧祛邪、扶正、補(bǔ)虛、健脾、益氣、補(bǔ)腎[4]?？鄥ⅫS芪湯就是以“活血化瘀”為基本治則,兼以扶正、益氣、清熱解毒、利濕退黃,以多途徑抗肝纖維化的形成。本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果從血清學(xué)到肝組織病理學(xué)均證實(shí)苦參黃芪湯能有效的防治實(shí)驗(yàn)性大鼠肝纖維化的形成,其作用機(jī)制可能有以下幾個(gè)方面:

[1]張盈濤,萇新明,李 欣,等.螺內(nèi)酯對肝纖維化大鼠Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)的影響[J].世界華人消化雜志,2001,9(5):1120-1124.

[2]Scheuer PJ.Classification of chronic viral hepatitis:a need for reassess ment[J].J Hepatol,1991,13:372-374.

[3]GRABB D W.Pathegenesis of alcoholic liver discase.Newer mechanismes of injury[J].Keio JMed,1999,48(4):184-188.

[4]李延利,劉中中,王建華,等.血府逐瘀湯對大鼠實(shí)驗(yàn)性肝纖維化病理變化的影響[J].中醫(yī)藥信息,1996,3(2):56-58.

[5]GressnerAM,Weiskirchen R,BreitkopfK,et al.Roles of TGF-beta in hepatic fibrosis[J].Front Biosci,2002,7:d793.

[6]Blobe GC,Schie mann WP,Pepin M C,et al.Functional role for the cytoplas mic domain of the typeⅢtransforming growth factor beta receptor in regulating transforming growth factor bate signaling[J].JBiolChem,2001,276(27):24627.

[7]T AM ATANI T,KOBAYASHI H,TEZUKA K et al.Establish ment of the enzymelinked immunosorbent assay for connective tissue growth factor(CTGF)and its detection in the sera of biliary atresia[J].Biochem Biophys Res Commum,1998,251(3):748-749.

[8]SAEGUSA,ISA JIS,KAW ARADA Y.changes in serum hyaalaronic acid levels and expression of CD44 M RN A in hepatic sinusoidal endothelial cell after majar hepatectomy in cirrhotic rats[J].world J Surg,2009,26(6):694-696.

[9]賈 皚,張盈濤,萇新明,等.螺內(nèi)酯對實(shí)驗(yàn)性大鼠肝組織 TGF-B1、PTGF-B及 a-SM A表達(dá)的影響[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2004,25(1):64-75.