韓冰冰 王世軍 趙海軍 山東中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院(濟南 250355)

建立規(guī)范的動物模型評價體系是中醫(yī)證候動物模型研究的重要環(huán)節(jié)。寒證是基本的中醫(yī)證候類型,作為中醫(yī)證候研究的重要切入點,具有寒證共性的中醫(yī)證候模型的創(chuàng)建與評價一直受到關注。本實驗采用中藥復方復制動物模型,采用 PLS法對模型表征進行評價分析,以期建立符合中醫(yī)理論的動物模型及評價體系。

1 材料與方法 1.1 實驗動物 SPF級 Wistar大鼠,30只 ,體重 200±20g,雌雄各半 ,由山東魯抗醫(yī)藥集團提供 ,動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(魯)20080002。

1.2 實驗儀器 M C-142L型電子體溫計,歐姆龍大連有限公司;DT-880B型手持式紅外人體表面溫度快速篩檢儀,深圳市華盛昌機械實業(yè)有限公司;H-ZYC-1型四通道自主活動儀,淮北正華生物儀器公司;XRY-1A型數(shù)顯氧彈熱量計,上海昌吉地質(zhì)儀器有限公司。

1.3 藥物及試劑 生石膏產(chǎn)于湖北應城,知母產(chǎn)于河北易縣,黃柏產(chǎn)于四川滎經(jīng),龍膽草產(chǎn)于吉林臨江,均經(jīng)山東中醫(yī)藥大學李峰教授鑒定。苯甲酸(國家標準物質(zhì)),中國計量科學研究院 ,批號:200903。

1.4 造模方法與分組 實驗動物隨機分為空白對照組(10只)、虛寒組 (20只 )。虛寒組用生石膏、龍膽草、黃柏和知母,按照 2∶1.2∶1∶ 1.5比例,制成 4g/mL水煎劑,灌胃 1.6mL/100g,每天 1次 ,連續(xù) 14d。

1.5 指標檢測 1.5.1 一般狀況:仔細觀察各組動物的活動狀態(tài)、毛發(fā)潔凈度、毛發(fā)疏密度、毛發(fā)光澤、爪色、耳色、舌色等情況,計入一般狀況表。

1.5.2 肛溫:晚 18時開始測量:將涂有凡士林的測溫探頭插入直腸約 3cm,測溫計顯示數(shù)字穩(wěn)定蜂鳴音提示后讀取數(shù)字。

1.5.3 趾溫:使用紅外體溫儀檢測大鼠趾溫。

1.5.4 寒熱趨向:使用自制寒熱趨向行為測定儀檢測大鼠寒熱趨向。事先預熱預冷,將寒、熱箱溫度分別控制在低于室溫 3℃和高于室溫 3℃(室溫 24℃左右)。測試時 ,將大鼠置于大鼠常溫箱 3次,記錄大鼠進寒熱箱的次數(shù)。

1.5.5 自主活動:采用開場實驗法,使用自主活動儀記錄各組大鼠 5min自主活動次數(shù)。

1.5.6 攝食量、飲水量、糞便、尿液:上午 8點將大鼠放入代謝籠,觀察并記錄其 24h攝食量、飲水量、尿液 (量、色、質(zhì))、糞便 (量、色、質(zhì) )。

1.5.7 單位體重攝入能、糞便能、消化能、可代謝能:將大鼠放入代謝籠,每籠 1只,觀察并收集其 24h糞便,置 65℃電熱鼓風干燥箱干燥至恒重,稱重(精確至 0.001g)。使用 XRY-1A數(shù)顯氧彈熱量計檢測飼料及實驗動物的糞便熱值。分別計算其攝入能、糞便能、消化能、可代謝能等能量代謝指標(隨尿損失的能量按消化能的 2%計算)。具體公式如下:

攝入能(kJ/d)=攝入干物質(zhì)量(g/d)×食物熱值 (kJ/g);

糞便能(kJ/d)=糞便干重(g/d)×糞便熱值 (kJ/g);

消化能(kJ/d)=攝入能(kJ/d)-糞便能(kJ/d);

可代謝能 (kJ/d)=消化能(kJ/d)-尿(kJ/d)=消化能(kJ/d)×98%

以上指標分別除以體重即單位體重攝入能、糞便能、消化能、可代謝能。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用 Tanagra1.4進行偏最小二乘回歸(PLS)數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié) 果 2.1 實驗數(shù)據(jù)處理 實驗數(shù)據(jù)進行標準化處理,自變量表見表 1。

表1 虛寒證模型指標變量標識表

2.2 虛寒證 PLS回歸模型 建立虛寒證 PLS回歸模型,表達式如下:

y=3.178514+ 0.055077X1-0.003064X2+0.000141X3-0.050202X4-0.09268X5-0.000358X6-0.023644X7+ 0.020232X8+0.140244X9+ 0.038486X10+ 0.053456X11-0.091105X12+ 0.133617X13+ 0.005275X14+ 0.002452X15-0.010199X16+ 0.08835X17+ 0.003022X18-0.048857X19+0.119771X20

與虛寒證模型呈 正相關的變量有:X1、X3、X8、X9、X10、X11、X13、X14、X15、X20,與虛寒證模型呈負相關的變量有:X2、X4、X5、X6、X7、X12、X16、X17、X18、X19。

2.3 VIP變量投影重要性指標 變量投影重要性指標用來描述自變量對因變量的解釋能力 ,VIP值越大,自變量 x對 y的解釋能力越強,見圖 1。

圖1 虛寒證模型的V IP直方圖

如圖所示,對虛寒模型與空白比模型有重要貢獻(解釋能力 )的指標有:X20(1.9258)、X9(1.6881)、X17(1.5394)、X2(1.3964)、X5(1.3576)、X6(1.2253)、X14(1.1664)、X18(1.0635),VIP值均大于 1。

2.4 模型散點分布圖 見圖 2。

圖2 虛寒證模型散點分布圖

如圖所示,虛寒組和空白對照組樣本點完全分離,兩組組之間未見任何交叉與重疊,得到了明顯區(qū)分,證明造模成功。模型評價回代判別正確率 100%,用留-法交叉驗證判別正確率80.77%。

2.5 模型得分見表 2。

表2 虛寒證大鼠模型評價分值

3 討 論 自 1978年起北京醫(yī)科大學梁月華等根據(jù)中醫(yī)理論“寒涼藥易傷陽氣,陽虛則寒”開始探索給大鼠長期大量服用寒涼藥復制虛寒證動物模型[1]。在此基礎上,梁氏進行了大量基礎研究[2,3],對虛寒證大鼠的神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫等多系統(tǒng)多項指標進行檢測,結(jié)果證明寒涼藥使交感神經(jīng)一腎上腺(皮質(zhì)、髓質(zhì))系統(tǒng)機能活動減弱,代謝降低,此結(jié)果與臨床所觀察的寒證、熱證患者的表現(xiàn)一致。另外,梁氏還采用藥物反證,發(fā)現(xiàn)溫補方藥對虛寒證大鼠神經(jīng)內(nèi)分泌方面也均有調(diào)整作用[4]。在梁氏基礎上,陳小野等又進行了深入的探索。陳氏認為[5],梁氏的虛寒證和虛熱證動物模型在寒證和熱證上基本得到公認,但存在兩個環(huán)節(jié)的不足:一是可能未能在寒、熱證的基礎上達到寒邪傷陽而致虛,熱邪傷陰而致虛;二是在虛證上未達到“精氣奪則虛”。陳氏認為,如造模時間或造模強度不足,虛證階段仍有可能不能達到。因此嘗試通過加大造模量改進這一模型并進行了大量指標的檢測[6],證實該模型有程度較深的證候表現(xiàn),并出現(xiàn)虛證,同時指出生物學特性的相關性同樣為機體的重要生理病理特征,應引起重視。

本實驗造模方藥選自陳氏復方,用生石膏、龍膽草、黃柏和知母,按照 2:1.2:1:1.5比例,制成 4g/mL水煎劑,灌胃 4mL/d。造模藥量比梁氏用量大幅度增加,預實驗用藥兩周左右時發(fā)現(xiàn)動物開始出現(xiàn)少量死亡,并隨時間延長死亡數(shù)量逐漸上升,提示耐受達到極限,因此確定造模時間為 14d。

模型復制結(jié)束后,進行模型表征的檢測,并采用 PLS數(shù)據(jù)分析進行模型評價,PLS是一種新興的統(tǒng)計方法,它集多元線性回歸、典型相關分析和主成分分析的基本功能為一體,將建模預測類型的數(shù)據(jù)分析方法與非模型式的數(shù)據(jù)認識方法有機地結(jié)合起來,因此,偏最小二乘回歸較傳統(tǒng)的回歸分析、主成分分析具有更大優(yōu)勢,能較好地處理基于傳統(tǒng)最小二乘回歸方法難以解決的問題,在處理樣本容量小、自變量多、變量間存在嚴重多重相關性問題方面具有獨特的優(yōu)勢,從而使模型精度、穩(wěn)健性、實用性得到提高。

PLS模型顯示虛寒組和空白對照組樣本點完全分離,得到明顯區(qū)分,對虛寒模型有重要貢獻 (解釋能力)的指標有:糞質(zhì)地、毛發(fā)潔凈度、尿色、體重、平均趾溫、自主活動、飲水量、尿質(zhì)地。其中糞質(zhì)地、毛發(fā)潔凈度、飲水量與模型呈正相關,體重、尿色、尿質(zhì)地、平均趾溫、自主活動與模型呈負相關。 PLS數(shù)據(jù)分析證實大便溏稀,毛發(fā)污穢,飲水量多,體重減輕,趾端溫度低,活動量少為虛寒證模型動物的主要癥狀及體征。這與虛寒證的臨床診斷基本相符,體現(xiàn)了虛寒證“陽虛內(nèi)寒”的病理特點。本實驗采用 PLS法建立了虛寒證模型的表征評價體系,這對于豐富與完善虛寒證動物模型的評價標準,推動中醫(yī)證候動物模型的規(guī)范化進程,具有積極的科學意義和廣闊的應用前景。

[1]梁月華,王 晶,謝竹藩.寒涼藥與溫熱藥對交感神經(jīng)腎上腺及代謝機能的影響[J].北京大學學報(醫(yī)學版),1987,19(1):54-57.

[2]楊 勇,梁月華,汪長中,等.虛寒、虛熱證大鼠神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫與血液流變學的時相性研究[J].中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志,2002,8(2):109-112.

[3]李 良,劉國貞,梁月華.虛寒證鼠服溫熱藥后腦、垂體和腎上腺內(nèi) 5-羥色胺及去甲腎上腺素神經(jīng)元和神經(jīng)纖維的變化[J].中醫(yī)雜志,2000,41(10):623-626.

[4]宋 輝,梁月華.溫陽和補氣藥對虛寒證大鼠神經(jīng)內(nèi)分泌的影響[J].中國中藥雜志,1997,22(3):182-186.

[5]陳小野,周永生,樊雅莉,等.大鼠虛寒證模型的研制[J].中國實驗動物學報,2001,9(3):155-158.

[6]樊雅莉,張宇鵬,蔣小麗,等.大鼠虛寒證模型部分指標相關性的初步研究[J].實驗動物科學與管理,2003,20(1):4-7.