肖秀麗 王振宜 唐漢鈞 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院寶山分院中醫(yī)外科(上海 201900)

創(chuàng)面愈合是皮膚外科領(lǐng)域中一個(gè)重要問題,而糖尿病、截癱、局部射線照射等所致的創(chuàng)面臨床愈合困難,因此探究創(chuàng)面修復(fù)與再生的機(jī)理,尋找有效地促進(jìn)創(chuàng)面愈合的治療方法,有著十分重要的意義。復(fù)黃生肌愈創(chuàng)(FuhuangShengji Yuchuang,FH-SJYC)油膏,簡(jiǎn)稱復(fù)黃膏 ,是唐漢鈞教授根據(jù)長期治療皮膚創(chuàng)面的經(jīng)驗(yàn) ,根據(jù)其“瘀祛新生”理論所創(chuàng)制,對(duì)各種難愈性創(chuàng)面具有較好的效果[1]。為進(jìn)一步探討祛瘀生肌法促進(jìn)創(chuàng)面愈合機(jī)制,本研究擬通過大鼠糖尿病創(chuàng)面模型外用復(fù)黃膏后創(chuàng)面中生長因子變化的動(dòng)態(tài)研究,探討其部分作用機(jī)理。

1 材料與方法 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 清潔級(jí) Wistar大鼠,雄性,體質(zhì)量(220±20)g,共 54只。由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供,動(dòng)物許可證號(hào)為醫(yī)動(dòng)字第 SCXK(滬)2003-0003號(hào)。用隨機(jī)數(shù)字表法先按大鼠造模后換藥 3d和 11 d兩個(gè)觀測(cè)時(shí)段將其隨機(jī)分為 2組,每組 27只;再將每一時(shí)段的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按隨機(jī)數(shù)字表法分為創(chuàng)面對(duì)照組、模型組和復(fù)黃膏組,每組 9只。

1.2 藥物組成及制備 復(fù)黃生肌愈創(chuàng)油膏(復(fù)黃膏),由紫草、血竭、大黃、龍骨、雞蛋黃、珍珠層粉、豬皮、麻油等組成。由上海中醫(yī)藥大學(xué)龍華醫(yī)院制劑室制備成油膏(藥劑批號(hào)為040720)。正常對(duì)照組和糖尿病對(duì)照組:生理鹽水(龍華醫(yī)院提供)。

1.3 試劑和儀器 四氧嘧啶(Alloxan),試劑編號(hào):2244-11-3,瑞士 FULKA公司產(chǎn)品(由上海中醫(yī)藥大學(xué)藥理毒性實(shí)驗(yàn)室提供)。羅氏 ACCU-CHEK ACTIVE血糖儀和血糖測(cè)試試紙,編號(hào):2005-10,22896931,瑞士 Roche公司產(chǎn)品。0.1%鹽酸氯胺酮,試劑編號(hào):KD061201,江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品。RT試劑盒 DR019A,廣州中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司產(chǎn)品。M ARK D501A,上海寶生物工程技術(shù)公司產(chǎn)品。RN A反轉(zhuǎn)錄試劑盒,T AKARA公司產(chǎn)品。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR試劑盒,美國 ABI公司產(chǎn)品。全自動(dòng)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀(美國 ABI 7300),美國 ABI公司產(chǎn)品。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法 1.4.1 動(dòng)物創(chuàng)面造模:糖尿病大鼠模型制造參照傅小兵等[2]方法改進(jìn),隨機(jī)分為正常對(duì)照組 ,糖尿病對(duì)照組和糖尿病實(shí)驗(yàn) (復(fù)黃膏)組,禁食 24 h后 (飲水不限),分別在乙醚麻醉下尾靜脈 1次注射 1.5%四氧嘧啶(50 mg/kg,實(shí)驗(yàn)組)及等體積生理鹽水(對(duì)照組 ),造模后 4 h后給予 5%葡萄糖水溶液飲用,次日經(jīng)尾部取血測(cè)血糖,血糖值大于 10mmol/L上 ,則表明造模成功。模型制成后,每 3天測(cè)血糖 1次,直到動(dòng)物處死。創(chuàng)面造模:糖尿病大鼠模型制造完成后 3d,參照傅小兵等[3]方法改進(jìn),Wister大鼠用 1%鹽酸氯胺酮(3 mL/kg)腹腔注射麻醉。局部備皮,常規(guī)消毒后,于 Wister大鼠背部取直徑為 3 cm左右圓形切口,剪開皮膚全層,至皮下筋膜,無菌敷料加蓋 ,每日換藥 1次。創(chuàng)面對(duì)照組造模方法同上。造糖尿病模型時(shí)大鼠共死亡 8只,在創(chuàng)面模型造模時(shí)死亡 5只,治療、飼養(yǎng)過程中又有 3只大鼠死亡。最后可供實(shí)驗(yàn)觀察的大鼠共 38只,其中 3和 11 d兩個(gè)時(shí)間段各 19只 ,每個(gè)時(shí)間段又分為 3組,其中創(chuàng)面對(duì)照組 7只,模型組和復(fù)黃膏組均為 6只。

1.4.2 用藥:3組大鼠于造模當(dāng)日開始換藥,換藥前用 1:5 000呋喃西林清潔創(chuàng)面。創(chuàng)面對(duì)照組和模型組外敷單層生理鹽水紗布,復(fù)黃膏組外敷單層復(fù)黃膏紗布。3組大鼠傷口均外用兩層消毒干紗布覆蓋固定 ,每日換藥 1次。

1.4.3 動(dòng)物創(chuàng)面面積測(cè)量及標(biāo)本采集:用藥后第 3天和第 11天,分別將動(dòng)物麻醉處死。測(cè)量創(chuàng)傷面積,并計(jì)算創(chuàng)面閉合指數(shù)。計(jì)算公式:創(chuàng)面閉合指數(shù)=(1-治療后創(chuàng)面面積/原始創(chuàng)面面積)×100%。用眼科手術(shù)剪分離新生創(chuàng)面肉芽組織,并成塊取下,為所需實(shí)驗(yàn)樣品。

1.4.4 Real-time RT-PCR實(shí)驗(yàn)步驟:1.4.4.1 引物、探針的設(shè)計(jì)與合成:根據(jù) GenBank提供的 CRD-BP mRNA序列(LOCU S ID:AF198254),利用 Primer Premier5.0設(shè)計(jì)內(nèi)、外引物及探針,引物均跨內(nèi)含子序列,保證擴(kuò)增的特異性。(引物、探針由中山大學(xué)達(dá)安基因診斷中心合成。)引物和探針序列Custom_NameSequence ProModify:FRT GF-β15'-CGCCT

GAGTGGCTGTCTT TTG-3'5'端 FAM修飾;3'端 Tamra修飾5'-GCTGCTGACCCCCACTGAT-3'5'-TGCCGGACAACT CCAGTGA-3'CollagenⅠ5'-AAGGCTGCAACCTGGATGCC ATCA-3'5'端 FAM修飾 ;3'端 Tamra修飾 5'-GGAGAGTA CTGGATCGACCCTAAC-35'-CTGACCTGTCTCCATGT T GCA-3'CollagenⅢ5'-ATGTCTGGAAGCCAGAACCATGT CA-3'5'端 FAM修飾 ;3'端 Tamra修飾 5'-CTACCTTGGT CAGTCCTATGAGTCTAGA-35'-TCCCGAGTCGCAGAC ACAT AT-3'GAPDH5'-CATCCTGGGCTACACTGAGGAC CA-3'5'端 FAM修飾 ;3'端 Tamra修飾 5'-CCGAGGGCCCA CTAAAGG-3'5'-GCTGT TGAAGTCACAGGAGACAA-3'

1.4.4.2 組織 RN A提取:將所試驗(yàn)的標(biāo)本按序排放在管架,依次將各組組織轉(zhuǎn)移至 5 mL玻璃試管中,依次每一管中加入 1 mL TRIzol(預(yù)冷 ),電動(dòng)勻漿器 (轉(zhuǎn)速 8000r/min)處理 30～ 45s。每標(biāo)本間處理后用酒精(75%乙醇的配置∶ 1倍的DEPC處理水加 3倍的無水乙醇)棉球擦拭,DEPC處理水清洗。依次將勻漿液轉(zhuǎn)至 1.5mL Eppendorf管中,各管中加入氯仿 200μL,激烈振蕩 15s,4℃、12 000 r/min離心 15 min。小心吸出水層加入依次編號(hào)的 Eppendorf管中,再加入二倍體積的異丙醇(約 600μL),混勻,置于-20℃冰箱中,30min。 4℃、10 000r/min離心 15min,棄上清留沉淀。用 650μL75%乙醇洗滌沉淀,4℃,8 000 r/min,離心 5min,棄上清留沉淀 ,并重復(fù)此步驟 1次,充分吸盡殘留液。打開管蓋,干式恒溫器 65℃,5～10min,烘干。 20μL DEPC處理水溶解 RNA,進(jìn)行電泳并進(jìn)行紫外分析測(cè)定,合格者-20℃冰箱保存待用。

1.4.4.3 RNA濃度測(cè)定:測(cè)同一樣品在 260nm和 280nm光吸收值,若 OD260nm/OD280nm接近 2.0,則說明樣品純度高。

1.4.4.4 RN A變性凝膠電泳:用 DEPC處理的適量蒸餾水,加熱融化瓊脂糖。待冷卻到 60℃,加 10mL 10× MOPS電泳液和 18mL 37%甲醛至終濃度為 2.2mol/L?；靹蚝?澆板,插梳。 取 RNA 20～30 μg溶于 4.5μL DEPC處理的蒸餾水,加2μL10× MOPS電泳液 3.5μL,甲醛 10μL甲酰胺 (終體積為20 μL)。變性溫度為 65℃,15min。樣品變性后立即置于冰浴。加上樣染色液,上樣。將變性瓊脂糖凝膠裝入含有 1× MOPS電泳緩沖液的電泳槽(經(jīng) 3%過氧化氫處理)中。預(yù)電泳 5min,加樣品。電泳,50V,3h。電泳后,EB染色,照像(用薄膜包膠 )。

1.4.4.5 RT-PCR實(shí)驗(yàn)步驟:將 RT-PCR試劑盒從-80℃冰箱取出,復(fù)融,將 5×逆轉(zhuǎn)錄 buffer,dNT Ps,MM LV,上游引物 F,下游引物 R,10 000r/min,數(shù)秒。將經(jīng)過稀釋后的 RN A樣本進(jìn)行 RT,反應(yīng)體系為:5×逆轉(zhuǎn)錄 buffer4μL、上游引物 F 0.4 μL、下游引物 R 0.4μL、dN TPs 0.2 μL、逆轉(zhuǎn)錄酶 MM LV 1μL、DEPC處理水 10 μL、RNA模板 4μL,總體積 20μL。依次插入預(yù)先設(shè)置(37℃ 1h、95℃ 5min)加熱模塊。逆轉(zhuǎn)錄 cDN A完成,放入-80℃冰箱備用。

1.4.4.6 FQ-PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)步驟:取出實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(達(dá)安公司 )解凍,取出消毒好的 96孔聯(lián)體反應(yīng)板,分別加入 cDNA模板。 依次加入 Taq酶 1μL、dN TPs0.5μL、上、下游引物各 0.5μL、熒光標(biāo)記探針 0.5μL、5×buffer 10 μL、ddH2O 32μL、cDNA 5 μL,總體積 50 μL。放入全自動(dòng)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀(美國 ABI7300)板槽中。擴(kuò)增條件:50℃ 2min,95℃ 10min,95℃ 15s、60℃ 1min,共 40個(gè)循環(huán),反應(yīng)完數(shù)據(jù)保存。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。在統(tǒng)計(jì)過程中進(jìn)行了正態(tài)分布檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn),數(shù)據(jù)滿足方差分析條件,組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用 t檢驗(yàn),P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果 2.1 復(fù)黃膏對(duì)糖尿病大鼠創(chuàng)面閉合指數(shù)的影響 在用藥第 3天和第 11天,模型組的創(chuàng)面閉合指數(shù)均明顯低于創(chuàng)面對(duì)照組(P＜0.05);復(fù)黃膏組的創(chuàng)面閉合指數(shù)則明顯高于模型組(P＜0.05),與創(chuàng)面對(duì)照組相當(dāng)(P＞0.05)。見表1。

表1 復(fù)黃膏用藥第 3天和第 11天對(duì)大鼠糖尿病創(chuàng)面閉合指數(shù)的影響(±s,%)

表1 復(fù)黃膏用藥第 3天和第 11天對(duì)大鼠糖尿病創(chuàng)面閉合指數(shù)的影響(±s,%)

△P＜0.05,vs創(chuàng)面對(duì)照組;▲P＜0.05,vs模型組

創(chuàng)面閉合指數(shù)組 別 n 3rd day 11th day創(chuàng)面對(duì)照組 7 3.11±1.53 77.62±10.00模型組 6 0.78±0.57△ 42.39±9.78△復(fù)黃膏組 6 2.36±1.30▲ 78.01±8.85▲

2.2 復(fù)黃生肌愈創(chuàng)油膏對(duì)糖尿病大鼠創(chuàng)面中 TGF-β1、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原 mRNA表達(dá)影響 創(chuàng)面修復(fù) 3d時(shí),復(fù)黃膏組創(chuàng)面中 TGF-β1mRN A表達(dá)量均明顯高于模型組(P＜0.05),但和創(chuàng)面對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;Ⅰ、Ⅲ型膠原 mRN A表達(dá)量 3組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表 2。創(chuàng)面修復(fù) 11d時(shí),復(fù)黃膏組創(chuàng)面中 TGF-β1和Ⅰ型膠原 mRNA表達(dá)明顯低于創(chuàng)面對(duì)照組(P＜0.05),但和模型組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;復(fù)黃膏組Ⅲ型膠原 mRNA表達(dá)明顯高于模型組(P＜0.05),但和創(chuàng)面對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表 3。

表2 復(fù)黃生肌愈創(chuàng)油膏對(duì)糖尿病大鼠創(chuàng)面3dT GF-β1、Ⅰ 型膠原、Ⅲ 型膠原m RNA水平影響 (±s,%)

表2 復(fù)黃生肌愈創(chuàng)油膏對(duì)糖尿病大鼠創(chuàng)面3dT GF-β1、Ⅰ 型膠原、Ⅲ 型膠原m RNA水平影響 (±s,%)

▲P＜0.05,vs模型組

Group n TGF-β 1 Ⅰ型膠原 Ⅲ型膠原創(chuàng)面對(duì)照組 7 2.82± 3.08 2.37± 2.85 2.80± 3.55模型組 6 1.10± 1.23 1.98± 1.14 0.69± 0.62復(fù)黃膏組 6 4.76±3.63▲ 1.49± 1.32 2.49± 3.26

表3 復(fù)黃生肌愈創(chuàng)油膏對(duì)大鼠糖尿病創(chuàng)面 11d T GF-β1、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原m RNA水平影響(±s,%)

表3 復(fù)黃生肌愈創(chuàng)油膏對(duì)大鼠糖尿病創(chuàng)面 11d T GF-β1、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原m RNA水平影響(±s,%)

△P＜0.05,vs創(chuàng)面對(duì)照組;▲P＜0.05,vs模型組

Group n TGF-β1 Ⅰ型膠原 Ⅲ型膠原創(chuàng)面對(duì)照組 7 2.69± 1.63 7.16± 5.93 2.33± 1.98模型組 6 0.33± 0.30* 0.87± 0.62* 0.45± 0.24復(fù)黃膏組 6 0.53± 0.32* 1.77± 0.99* 3.56± 2.31▲

3 討 論 復(fù)黃生肌愈創(chuàng)油膏是根據(jù)糖尿病潰瘍“虛甚瘀重,瘀甚虛重”的病機(jī)立法,以祛瘀扶正,方以大黃、蛋黃油為主藥,一以活血祛瘀,一以扶正生肌;以紫草、血竭助大黃祛瘀止痛,珍珠粉等助蛋黃油生肌收口,佐以龍骨收瘡斂口,麻油生肌潤膚;象皮斂瘡生肌 ,促進(jìn)局部傷口愈合。全方合用,有活血祛瘀、生肌收口之功效,在臨床促進(jìn)難愈性創(chuàng)面愈合治療上取得了一定的療效[4]。本實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物模型創(chuàng)面閉合指數(shù)結(jié)果顯示,復(fù)黃膏組的效果接近創(chuàng)面對(duì)照組。 TGF-β是成纖維細(xì)胞的強(qiáng)效趨化因子,可以通過旁分泌和自分泌直接或間接、單獨(dú)或協(xié)同、同時(shí)或不同時(shí)相作用于炎癥及修復(fù)細(xì)胞,產(chǎn)生細(xì)胞的趨化性遷移、增生分化,細(xì)胞外基質(zhì)合成及分泌三類重要的生物學(xué)效應(yīng)。陳偉等[5]研究發(fā)現(xiàn):機(jī)體內(nèi) TGF-β的 3種異構(gòu)體的生物學(xué)功能不盡相同,與 TGF-β2、β3相比 ,TGF-β1與傷口修復(fù)愈合的關(guān)系最為密切。創(chuàng)面修復(fù)延遲的原因可能是由于潰瘍處的TGF-β1因子含量下降 ,而 TGF-β2和 TGF-β3蛋白表達(dá)增強(qiáng) ,引起肉芽生長緩慢,血液供應(yīng)不足,基質(zhì)纖維蛋白代謝失調(diào)等,最終導(dǎo)致潰瘍的發(fā)生[6]。用藥 3d時(shí),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:復(fù)黃膏組 TGF-β1mRNA百分比數(shù)值明顯高于模型組,P＜0.05,但和創(chuàng)面對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 ,與 TGF-β1蛋白檢測(cè)結(jié)果一致。提示復(fù)黃生肌愈創(chuàng)油膏在創(chuàng)面愈合早期可以促進(jìn)糖尿病難愈性創(chuàng)面中 TGF-β1的分泌,從而達(dá)到促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用。在已知的細(xì)胞因子中 TGF-β被公認(rèn)為是最重要的致纖維化細(xì)胞因子,是促進(jìn)成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的重要因子。抑制 TGF-β1的生物學(xué)作用可降低成纖維細(xì)胞增殖,有助于改善增生性瘢痕的形成,對(duì)萎縮性瘢痕的治療有一定的指導(dǎo)意義。用藥 11d時(shí),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:復(fù)黃膏組創(chuàng)面中 TGF-β1mRNA含量明顯低于創(chuàng)面對(duì)照組(P＜0.05),但和模型組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;與 TGF-β1蛋白檢測(cè)結(jié)果一致。提示復(fù)黃生肌愈創(chuàng)油膏在創(chuàng)面愈合后期可能具有抑制糖尿病難愈性創(chuàng)面中 TGF-β1分泌的作用,從而降低纖維細(xì)胞過度增殖,減少瘢痕形成。

膠原在創(chuàng)傷修復(fù)中是構(gòu)成修復(fù)組織的主要細(xì)胞外基質(zhì)成分,對(duì)于修復(fù)過程的完成有著極其重要的作用。愈合初期成纖維細(xì)胞被激活,合成和分泌膠原,膠原的產(chǎn)生既是創(chuàng)面修復(fù)的重要過程,也是瘢痕形成過程的決定性因素,故調(diào)控膠原的合成對(duì)于促進(jìn)創(chuàng)面愈合,減少瘢痕形成有著重要的意義。膠原在創(chuàng)面修復(fù)過程中,作為修復(fù)質(zhì)量的終結(jié)指標(biāo),決定著創(chuàng)面是否能順利修復(fù),以及修復(fù)質(zhì)量高低[7]。而膠原的類型很多,其中含量最豐富的是Ⅰ型和Ⅲ型膠原,在創(chuàng)面愈合過程中,Ⅰ、Ⅲ型膠原起著重要作用。Ⅰ型膠原纖維直徑為 100～ 500 nm,Ⅲ型膠原直徑為 40～60 nm,愈合的傷口中Ⅲ型膠原出現(xiàn)得比Ⅰ型膠原早[8]。Ⅲ型膠原含量越高 ,膠原纖維越細(xì),彈性越好,說明瘢痕的纖維化程度越低,膠原纖維就越細(xì),形成的瘢痕就越輕,故提高Ⅲ型膠原比例是減少瘢痕的重要手段[9]。本研究結(jié)果顯示,在創(chuàng)面修復(fù)的第 3天 ,3組間Ⅰ型膠原 mRNA的表達(dá)無明顯差異,但Ⅲ型膠原 mRNA的含量復(fù)黃膏組明顯高于模型組(P＜0.05);在創(chuàng)面修復(fù)的第 11天,復(fù)黃膏組創(chuàng)面中Ⅰ型膠原mRN A表達(dá)明顯低于創(chuàng)面對(duì)照組(P＜0.05),但和模型組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;復(fù)黃膏組Ⅲ型膠原 mRNA表達(dá)明顯高于模型組(P＜0.05),但和創(chuàng)面對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示應(yīng)用復(fù)黃膏具有促進(jìn)Ⅰ型、Ⅲ型膠原增生作用,尤其在創(chuàng)面愈合早期就可促進(jìn)Ⅲ型膠原的表達(dá),后期可以部分抑制Ⅰ型膠原的表達(dá),這可能是其促進(jìn)創(chuàng)面愈合、減少瘢痕形成的主要機(jī)制之一。因此,復(fù)黃膏有可能通過促進(jìn)糖尿病潰瘍創(chuàng)面Ⅰ、Ⅲ型膠原增殖及調(diào)節(jié)二者的平衡,從而發(fā)揮其促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用。

綜上,復(fù)黃生肌愈創(chuàng)油膏在糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合過程中可能通過影響 TGF-β1mRN A的分泌,從而調(diào)節(jié)Ⅰ、Ⅲ型膠原不同時(shí)段的表達(dá),起到促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用,同時(shí)可一定程度上減少瘢痕形成。

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