付萬冬 ，姚建亭 ，段德麟

（1.浙江省海洋開發(fā)研究院，浙江舟山 316100；2.中國(guó)科學(xué)院海洋研究所，山東青島 266071）

熱休克蛋白是一組在結(jié)構(gòu)上高度保守的蛋白質(zhì)，廣泛存在于原核和真核細(xì)胞中，正常情況下與應(yīng)激條件下都發(fā)揮重要的生理功能，但在脅迫條件（包括熱激、物理、化學(xué)和生物等脅迫因子）下，HSPs表達(dá)量顯著增加。HSPs參與維持蛋白質(zhì)空間構(gòu)象，保護(hù)細(xì)胞生命活動(dòng)，折疊和跨膜運(yùn)輸新生的蛋白，修復(fù)錯(cuò)誤折疊的蛋白，幫助降解變性的蛋白，穩(wěn)定細(xì)胞骨架和核骨架、增加細(xì)胞的抵抗能力等功能。

HSP70是熱休克蛋白家族中重要成員，廣泛分布于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和葉綠體等細(xì)胞的各個(gè)部分[1-3]。HSP70在生物對(duì)逆境的適應(yīng)，對(duì)減輕逆境脅迫引起的傷害和幫助生物度過不良環(huán)境中起到很大的作用。作為分子伴侶參與所有細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的從頭合成和定位、蛋白質(zhì)的加工和錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的降解及其調(diào)節(jié)過程，因而在正常條件或脅迫條件下，對(duì)于細(xì)胞的功能和代謝都起到重要的作用[4-7]。

海帶是潮間帶典型的褐藻，有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)價(jià)值。固著藻類隨潮汐變化，無法逃脫不利的生活環(huán)境，面臨嚴(yán)重的環(huán)境脅迫。因此，固著藻類必須有適當(dāng)?shù)纳砩淖円詰?yīng)對(duì)環(huán)境脅迫。到目前為止，已在一些藻類中開展了有關(guān)脅迫應(yīng)激的研究[8-15]，但有關(guān)HSP70在海藻抗逆環(huán)境脅迫中的作用一直未得到深入了解，因此，開展研究海藻受脅迫后，HSP70在抗逆中的作用具有重要的理論意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。在前期克隆得到海帶細(xì)胞質(zhì)定位的HSP70基因全長(zhǎng)cDNA序列基礎(chǔ)上[16-17]，將海帶HSP70基因的開放閱讀框區(qū)域克隆到表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化到原核表達(dá)系統(tǒng)，進(jìn)行體外表達(dá)。以期為進(jìn)一步研究藻類HSP70的生物學(xué)功能和海藻抗逆分子機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器試劑

1.1.1 材料處理

海帶cDNA由海帶總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成，大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)pLysS由本實(shí)驗(yàn)保存。

1.1.2 儀器和試劑

儀器：高壓滅菌鍋YXQ-LS-S（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，上海）；電子天平AB104-N（梅特勒-托利多儀器有限公司，上海）；臺(tái)式冷凍離心機(jī)5417R、常溫高速離心機(jī)5415D、Mastercycler Gradient PCR儀（Eppendorf儀器公司，德國(guó)）；電泳儀及水平電泳槽（大連捷邁科貿(mào)有限公司，遼寧）；水平電泳槽AE-7300（ATTO儀器公司，日本）；ImageMaster VDS成像系統(tǒng)（Pharmacia Biotech，瑞典）；Millipore純水系統(tǒng)（Millipore公司，美國(guó)）；超低溫冰箱（三洋儀器公司，日本）；超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)安泰公司，江蘇）。

試劑：Taq DNA 聚合酶（附帶 PCR buffer及 dNTPs）、RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0、PMD-18T（大連寶生物工程有限公司，中國(guó)）FastaGen小量膠回收試劑盒（飛捷生物技術(shù)有限公司，上海）；pEASY-E2 Expression Kit（北京全式金生物技術(shù)有限公司，北京）；LA Taq聚合酶（大連寶生物公司）；DNA Marker（天根生化科技有限公司，北京）；Nde I、Xho I內(nèi)切酶（Promega公司，美國(guó)）；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 海帶HSP70基因ORF的克隆

1.2.1 擴(kuò)增海帶HSP70 ORF引物的設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)已克隆測(cè)序的海帶HSP70基因核酸序列（Genbank Accession number：FJ375359），設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增海帶HSP70基因開放閱讀框，引物信息如下：上游引物L(fēng)JHSP70-EF：5′-ATGACAGCCGTCGAGGGAGAGAGCG-3′；下游引物 LJHSP70-ER：5′-GTCGATCTCCTCGATCTTGGGCCCG-3′。上游引物起始于起始密碼子，下游引物終止于終止密碼子前（不包括終止密碼子）。從海帶總RNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA中PCR擴(kuò)增出HSP70基因開放閱讀框，擴(kuò)增產(chǎn)物為1 971 bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司協(xié)助合成。

1.2.2 PCR 擴(kuò)增海帶 HSP70 基因 ORF

根據(jù)設(shè)計(jì)的引物L(fēng)JHSP70-EF和LJHSP70-ER從海帶cDNA中擴(kuò)增HSP70 ORF。PCR反應(yīng)體系的組成（共50 μL）：10×buffe（rMg2+，25 mM），5 μL；dNTP Mixture(10 mM each)，2 μL；Ex Taq聚合酶（2.5 U/μL），0.25 μl；海帶 cDNA，2 μL；引物（各 10 μM），2 μL；dH2O，36.75 μL。PCR 反應(yīng)條件：預(yù)擴(kuò)增 94 ℃，3 min；擴(kuò)增反應(yīng)35個(gè)循環(huán)；變性94℃，30 s；退火58℃，30 s；延伸72℃，2 min；最后延伸72℃，10 min。

1.3 HSP70表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

1.3.1 pEASY-E2(+)/HSP70 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

取PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠，100 V電泳30 min，在253 nm波長(zhǎng)下觀察拍照。目的產(chǎn)物用Fastagen小量DNA膠回收試劑盒純化，按說明書所示方法進(jìn)行。將純化的目的片段HSP70和pEASY-E2以體積比2:1混勻，在25℃下連接5 min。將連接好的重組質(zhì)粒命名為pEASY-E2(+)/HSP70。BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞的制備、pEASY-E2(+)/HSP70質(zhì)粒的連接和轉(zhuǎn)化等步驟參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第3版)。

1.3.2 pEASY-E2(+)/HSP70 表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

（1）PCR法鑒定正確表達(dá)方向的陽性重組子

挑選陽性克隆于10 μL無菌水中，渦旋混勻作為反應(yīng)模板，15 μL PCR反應(yīng)體系組成如下：2×Taq Mixer，7.5 μL；菌液，2 μL；LJHSP70-EF(10 μM)，1 μL；T7 terminator primer(10 μM)，1 μL；dH2O，3.5 μL。PCR反應(yīng)條件：預(yù)擴(kuò)增94℃，3 min；擴(kuò)增反應(yīng)35個(gè)循環(huán)；變性94℃，30 s；退火58℃，30 s；延伸72℃，2 min；最后延伸溫度72℃，10 min。取PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠，100 V電泳30 min，在253 nm波長(zhǎng)下觀察拍照。陽性克隆重組子在2 000 bp左右會(huì)有1條電泳條帶。

（2）限制性酶切分析陽性重組子

挑選正確表達(dá)方向的陽性重組子過夜培養(yǎng)。用堿裂解法提取質(zhì)粒，具體步驟參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》（第3版）。對(duì)提取的重組質(zhì)粒pEASY-E2(+)/HSP70，用Nde I和Xho I雙酶切，酶切反應(yīng)于37℃條件下保溫3～4 h，使酶切反應(yīng)完全。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定篩選的陽性克隆并照相。陽性克隆由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行克隆片段的DNA測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與HSP70核酸序列進(jìn)行比對(duì)。將含正確序列的陽性重組質(zhì)粒的表達(dá)菌株BL21(DE3)命名為BL21(DE3)/pEASY-E2(+)/HSP70。

1.4 海帶HSP70的體外表達(dá)和電泳檢測(cè)

將重組菌BL21(DE3)/pEASY-E2(+)/HSP70接種于5 mL含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃振蕩過夜培養(yǎng)。次日分別取出1 mL菌液接入3瓶50 mL相同的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2～3 h（OD600約0.6）后，加入終濃度分別為0 mM、1 mM和5 mM的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，于37℃振蕩培養(yǎng)不同時(shí)間，以BL21(DE3)/pEASY-E2(+)作為空白對(duì)照。每小時(shí)取出菌液1 mL，5 000×g離心10 min，收集菌體備用。

取上述不同時(shí)間階段的1 mL菌液離心得到的菌體加100 μL dH2O，分別與等體積的2×上樣緩沖液混合，100℃水浴5～8 min。上樣前8 000×g離心5 min。配制12%的SDSPAGE分離膠和5%的濃縮膠，取20 μL加樣于凝膠，在濃縮膠中20 mA，分離膠中40 mA進(jìn)行SDS-PAGE（Laemmli,1970）恒流電泳，電泳結(jié)束后將凝膠用聚丙烯酰胺凝膠染色液，染色15 min。染色結(jié)束后用脫色液將聚丙烯酰胺凝膠背景顏色脫色干凈，此時(shí)蛋白質(zhì)條帶可以清楚顯現(xiàn)出來。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增海帶HSP70的ORF

根據(jù)本研究得到海帶HSP70 cDNA序列信息，設(shè)計(jì)了表達(dá)海帶HSP70蛋白的引物，從海帶cDNA中擴(kuò)增出1 970 bp左右的DNA片段（圖1），和預(yù)期要擴(kuò)增的片段大小一致，是否目的片段還要進(jìn)一步驗(yàn)證以確定。

圖1 PCR擴(kuò)增海帶HSP70 ORF結(jié)果Fig.1 The result of ORF fragment of L.japonica HSP70 of PCR amplication

2.2 HSP70表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

2.2.1 PCR 擴(kuò)增鑒定陽性的重組子

將擴(kuò)增得到的目的片段進(jìn)行了膠回收，和PMD-18T載體進(jìn)行連接，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，將陽性克隆送往上海生工生物工程有限公司測(cè)序。確定是擴(kuò)增的目的片段后，將回收的目的片段和/pEASY-E2表達(dá)載體連接，再轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21(DE3)，挑選陽性克隆利用表達(dá)蛋白上游引物L(fēng)JHSP70-EF和表達(dá)載體T7終止引物序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定陽性的重組子。檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。根據(jù)結(jié)果可知挑選2個(gè)陽性重組子插入方向正確，可以進(jìn)行下步蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)。

圖2 PCR檢測(cè)陽性克隆的結(jié)果Fig.2 The result of detection of positive cloning fragment by PCR

2.2.2 限制性酶切分析陽性重組子

對(duì)提取的重組質(zhì)粒pEASY-E2(+)/HSP70，用Nde I和Xho I雙酶切，結(jié)果表明陽性克隆的質(zhì)粒能被兩種酶酶切成線性的質(zhì)粒片段和目的片段（圖3）。

圖3 pEASY-E2(+)/HSP70表達(dá)質(zhì)粒的Nde I和Xho I雙酶切圖譜Fig.3 Restriction patterns of plasmid pEASY-E2(+)/HSP70 digested with Nde I and Xho I

2.3 海帶HSP70基因體外表達(dá)

將構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì)粒pEASY-E2(+)/HSP70轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)，挑選陽性重組子進(jìn)行LB液體培養(yǎng)，當(dāng)菌液的OD600約0.6時(shí)，加入終濃度分別為0 mM，1 mM和5mM的IPTG在37℃下培養(yǎng)誘導(dǎo)，以空載體pEASY-E2(+)重組子作為對(duì)照。每小時(shí)取樣1次，檢測(cè)外源蛋白的表達(dá)量。結(jié)果表明空載體重組子在SDS-PAGE圖譜上無72 kDa左右的蛋白條帶（圖4）；無IPTG誘導(dǎo)的陽性重組子在SDS-PAGE圖譜上在72 kDa左右有1條非常微弱條帶（圖5）；而陽性重組子在1 mM或5 mM的IPTG誘導(dǎo)下，SDS-PAGE圖譜上在72 kDa左右有1條明顯的條帶（圖6，圖7），這與海帶HSP70的預(yù)測(cè)分子量72.03 kDa的結(jié)果相符合，說明海帶HSP70基因在體外成功地獲得了表達(dá)。不同時(shí)間對(duì)海帶HSP70蛋白誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果表明，海帶HSP70蛋白的產(chǎn)生與體外誘導(dǎo)時(shí)間顯著相關(guān)，未誘導(dǎo)的培養(yǎng)液中幾乎沒有HSP70蛋白的產(chǎn)生。在1 mM或5 mM的IPTG誘導(dǎo)下，伴隨誘導(dǎo)時(shí)間的增長(zhǎng)，HSP70蛋白的表達(dá)量顯著增加，當(dāng)誘導(dǎo)5 h以后，基因的表達(dá)達(dá)到平臺(tái)，繼續(xù)培養(yǎng)，HSP70的表達(dá)并不顯著增高。本研究中，5mM的IPTG誘導(dǎo)外源蛋白HSP70的表達(dá)量要高于相應(yīng)時(shí)刻1 mM的IPTG誘導(dǎo)外源蛋白HSP70的表達(dá)量。

圖4 不同培養(yǎng)時(shí)間下，BL21(DE3)/pEASY-E2(+)的SDS-PAGE分析Fig.4 Analysis of BL21(DE3)/pEASY-E2(+)by SDSPAGE in different cultured times

圖5 無IPTG，不同培養(yǎng)時(shí)間下，BL21(DE3)/pEASY-E2(+)/HSP70的SDS-PAGE分析Fig.5 Analysis of the E.coli BL21(DE3)/pEASY-E2(+)/HSP70)by SDS-PAGE in different cultured times at IPTG concentration of 0 mM.Lane M:Protein Marker;

圖6 1 mM IPTG誘導(dǎo)不同時(shí)間后，BL21(DE3)/pEASYE2(+)/HSP70的SDS-PAGE分析Fig.6 Analysis of the E.coli BL21(DE3)/pEASY-E2(+)/HSP70)by SDS-PAGE in different induced times at IPTG concentration of 1 mM.Lane M:Protein Marker;

圖7 5 mM IPTG，不同誘導(dǎo)時(shí)間，BL21(DE3)/pEASY-E2(+)/HSP70的SDS-PAGE分析Fig.7 Analysis of the E.coli BL21(DE3)/pEASY-E2(+)/HSP70)by SDS-PAGE in different induced times at IPTG concentration of 5 mM.Lane M:Protein Marker;

3 討論

重組子成功構(gòu)建是實(shí)現(xiàn)基因體外表達(dá)的關(guān)鍵。根據(jù)海帶HSP70基因的蛋白序列分析，將編碼HSP70成熟肽的開放閱讀框序列克隆到pEASY-E2表達(dá)載體上并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中。轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR篩選、序列測(cè)定以及SDS-PAGE電泳等多重鑒定，結(jié)果顯示，HSP70基因的插入方向正確、序列結(jié)構(gòu)完整、且基因片斷正確的插入到表達(dá)載體相應(yīng)的位置，成功地構(gòu)建了海帶HSP70基因的重組子。SDS-PAGE電泳分析顯示，與無插入片段的陰性對(duì)照相比，在預(yù)測(cè)大小區(qū)域內(nèi)，有72 kDa蛋白插入，證明海帶HSP70重組蛋白獲得了表達(dá)。

重組蛋白的高效表達(dá)，是體外獲得大量重組蛋白的基礎(chǔ)。體外表達(dá)受多種因素影響，包括培養(yǎng)溫度，誘導(dǎo)時(shí)間，誘導(dǎo)劑量等。不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)重組蛋白表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，菌體很快就能產(chǎn)生重組蛋白，重組蛋白的產(chǎn)量隨誘導(dǎo)時(shí)間而增加。約5 h后，其表達(dá)量達(dá)到平臺(tái)期，過長(zhǎng)時(shí)間的表達(dá)，重組蛋白的產(chǎn)量并沒有顯著增加。由于選擇質(zhì)粒帶有氨卞青霉素的抗性，在重組蛋白的表達(dá)過程中，氨卞青霉素具有很強(qiáng)的選擇作用，保證了重組質(zhì)粒的正常生長(zhǎng)。但是，氨卞青霉素本身很不穩(wěn)定，在細(xì)菌培養(yǎng)液中容易被降解，而失去對(duì)重組質(zhì)粒的保護(hù)。因此在重組蛋白的表達(dá)過程中，縮短培養(yǎng)時(shí)間對(duì)保證重組蛋白的純度、預(yù)防污染，都有重要的意義。

重組蛋白的純化方法很多，包括葡聚糖層析、等電點(diǎn)分離、親和層析、透析等多種技術(shù)。一般地，為獲得較高純度的蛋白質(zhì)，一般需要結(jié)合一種或幾種不同的純化技術(shù)共同進(jìn)行。本研究選用的表達(dá)載體是pEASY-E2，其上帶有6個(gè)組氨酸，6個(gè)組氨酸在高pH值時(shí)與Ni親和柱形成共價(jià)結(jié)合，從而可將其它菌體雜蛋白逐漸洗脫掉。然后逐漸降低pH，在低pH條件下6個(gè)組氨酸與Ni親和柱分離，從而將重組蛋白洗脫，最終獲得較純的重組蛋白。獲得的經(jīng)純化的重組蛋白，須經(jīng)離體和在體的活性鑒定，才可最終確定其生物學(xué)活性和潛在應(yīng)用價(jià)值，這部分的研究工作正在進(jìn)行中。

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