黃 薇，鄧尚貴，唐 艷，李淑芳，孔巧香

（浙江海洋學(xué)院食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江舟山 316000）

鱈魚Gadous macrocephaius是海洋深水魚，為底層冷水性群聚魚類，在我國主要產(chǎn)于黃海和東海北部，是我國北方沿海出產(chǎn)的海洋經(jīng)濟(jì)魚種之一，一直作為生產(chǎn)魚片、魚塊及風(fēng)味魚糕等的原料[1]。我國鱈魚年加工量（4～5）×105t[2]，在其生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生大量下腳料魚皮、魚骨及附著魚肉。其中鱈魚皮占加工量的7%～8%[3]，目前的利用仍處于初級階段，如僅僅將其加工為動物飼料等，產(chǎn)品附加值低。而魚皮干物質(zhì)中50%以上為膠原蛋白[4]，其生物效價(jià)較高，并含有大量人體需要的無機(jī)鹽，如鐵、鈣、鎂和磷等。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，將魚皮蛋白水解為易溶于水的小分子蛋白多肽或游離氨基酸，將更有利于人體消化與吸收。小分子多肽可以由腸道直接吸收，其吸收途徑比氨基酸的吸收途徑具有更大的輸送量，且在消化吸收性能、營養(yǎng)和生理效果等方面具有更大的優(yōu)越性[5]?？蓪⑺怍~皮蛋白作為營養(yǎng)強(qiáng)化劑或食品添加劑添加到食品中，不僅可作為手術(shù)后病人、腎炎患者、糖尿病患者和高血壓患者的療效食品，還可作為水產(chǎn)品調(diào)味料。水解多肽產(chǎn)品還具有抗過敏性、降低膽固醇、降低血壓、增強(qiáng)免疫等諸多生理功能，所以將海洋低值魚及其下腳料加工成水解蛋白多肽無疑具有廣闊的市場空間。

魚類及其副產(chǎn)物的降解方法中，由于酶水解法條件溫和，能在一定條件下進(jìn)行定位水解分裂產(chǎn)生特定的肽，且氨基酸不會被破壞，構(gòu)型也不發(fā)生變化，近年來多被采用。本文使用木瓜蛋白酶與風(fēng)味酶組合成的復(fù)合酶對鱈魚皮蛋白進(jìn)行酶解，以水解度為指標(biāo)，確定了最佳的酶解條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鱈魚皮，浙江海士德食品有限公司提供；風(fēng)味酶（400 000 U/g）和木瓜蛋白酶（2 000 000 U/g），均購自南寧龐博生物工程有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

JJ-2組織搗碎勻漿機(jī)，金壇市精達(dá)儀器制造廠；數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-4，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；pH計(jì)（DECTA320A/C），瑞士梅特勒托利多公司；JJ-1精密增力電動攪拌器，國華電器有限公司；EYELA冷凍干燥機(jī)，上海愛朗儀器有限公司；超聲波清洗機(jī)，上海新芝電子有限公司；DHG-9075A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 鱈魚皮酶解工藝

將鱈魚皮洗凈瀝干，剪碎，組織搗碎勻漿機(jī)搗碎，再加入由木瓜蛋白酶與風(fēng)味酶按照一定的復(fù)合比混合而成的復(fù)合酶，在一定條件下水解數(shù)小時(shí)。水解完成后，將水解液的溫度升高至90℃并持續(xù)加熱15 min以使酶失活。冷卻至室溫后，在4 500 r/min的轉(zhuǎn)速下離心20 min，取上清液為水解液并測定其水解度。

1.3.2 蛋白質(zhì)水解度（DH）的測定[6]

DH(%)=已水解的肽鍵數(shù)/原料中總肽鍵數(shù)×100=[(B-C)/(A-C)]×100

A：原料中總氨基氮數(shù)；B：水解液中的氨基氮數(shù)；C：原料游離的氨基氮數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 木瓜蛋白酶與風(fēng)味酶復(fù)合比對酶解的影響

在料液比1:1，溫度45℃，pH 7.0，酶解時(shí)間3 h的條件下，分別準(zhǔn)確稱取1 g鱈魚皮，加入30 000 U/g的混合酶，以DH為指標(biāo)，研究酶復(fù)合比對酶解的影響，結(jié)果如圖1所示。

從圖1可以看出，當(dāng)木瓜蛋白酶與風(fēng)味酶的比例為3:1時(shí)，水解度有最大值，高于或者低于該水平時(shí)，水解度均逐漸減小，因此，在后續(xù)試驗(yàn)中，均取復(fù)合比為3:1。

圖1 復(fù)合比對酶解的影響Fig.1 Effect of compound ratio on degree of hydrulysis

2.2 料液比對酶解的影響

在木瓜蛋白酶與風(fēng)味酶復(fù)合比取5:1，加酶量30 000 U/g，溫度50℃，pH 7.0，酶解時(shí)間3 h的條件下，以DH為指標(biāo)，研究料液比對酶解的影響，結(jié)果如圖2所示。

從圖2可以看出，當(dāng)料液比在1:1～1:2之間時(shí)，水解度隨著料液比的增加呈逐漸增加的趨勢，而當(dāng)料液比繼續(xù)增大時(shí)，水解度的變化趨于平緩。這是由于當(dāng)料液比較低時(shí)，底物濃度低，流動性好，與酶的結(jié)合較充分，水解度越來越大。但當(dāng)料液比繼續(xù)增大，底物的流動性越來越差，與酶的結(jié)合達(dá)到飽和，水解度變化也趨于平緩。因此，確定酶解的最佳料液比范圍為1:1～1:3。

圖2 料液比對酶解的影響Fig.2 Effect of material-to-liquid ratio on degree of hydrulysis

2.3 pH對酶解的影響

在木瓜蛋白酶與風(fēng)味酶復(fù)合比取5:1，加酶量30 000 U/g，料液比1:2，溫度50℃，酶解時(shí)間3 h的條件下，以DH為指標(biāo)，研究pH對酶解的影響，結(jié)果如圖3所示。

pH是影響酶解反應(yīng)的重要因素之一，酶分子以及底物蛋白質(zhì)分子的構(gòu)想和解離狀態(tài)會隨pH的變化而變化，從而影響酶與底物蛋白的結(jié)合。從圖3可以看出，當(dāng)pH小于6.5時(shí)，水解度隨著pH的增大而逐漸增加，當(dāng)pH大于6.5時(shí)，水解度隨pH的增加而逐漸降低。因此，確定酶解的最佳 pH 范圍在 5.5～6.5。

圖3 pH對酶解的影響Fig.3 Effect of pH value on degree of hydrulysis

2.4 溫度對酶解的影響

在木瓜蛋白酶與風(fēng)味酶復(fù)合比取5:1，加酶量30 000 U/g，料液比1:2，pH 6.0，酶解時(shí)間3 h的條件下，以DH為指標(biāo)，研究溫度對酶解的影響，結(jié)果如圖4所示。

從圖4可以看出，當(dāng)溫度小于45℃時(shí)，隨著溫度的升高，整個(gè)體系的內(nèi)能不斷增大，酶與底物蛋白的接觸機(jī)會增大，速度加快，水解度呈顯著上升的趨勢。而當(dāng)溫度高于45℃時(shí)，水解度隨著溫度的增加而逐漸降低，這是因?yàn)闇囟鹊纳呤姑赴l(fā)生了變性，水解效率降低。由此確定酶解的最佳溫度范圍在40～50℃。

圖4 溫度對酶解的影響Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on degree of hydrulysis

2.5 加酶量對酶解的影響

在木瓜蛋白酶與風(fēng)味酶復(fù)合比取5:1，料液比1:2，pH 6.0，溫度45℃，酶解時(shí)間3 h的條件下，以DH為指標(biāo)，研究加酶量對酶解的影響，結(jié)果如圖5所示。

從圖5可以看出，當(dāng)加酶量在10 000～30 000 U/g時(shí)，水解度隨著加酶量的增加而顯著升高，由于在一定時(shí)間里，隨著酶的增加，酶與肽鍵的接觸率增加，蛋白質(zhì)不斷被水解，肽鍵數(shù)不斷增加。而當(dāng)加酶量大于30 000 U/g時(shí)，水解度雖然也隨著加酶量量的增加而有所增大，但是變化趨勢較緩慢，一方面是由于酶不能被底物飽和，過剩的酶不能與底物發(fā)生作用，另一方面由于酶濃度太大，產(chǎn)生了自溶，導(dǎo)致酶解作用減弱。因此，確定酶解的最佳加酶量范圍為30 000～50 000 U/g。

圖5 加酶量對酶解的影響Fig.5 Effect of enzyme dose on degree of hydrulysis

2.6 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以蛋白質(zhì)水解度為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)法繼續(xù)研究了加酶量、pH值、酶解溫度和料液比等重要因子對酶解效果的影響，以確定最佳酶解條件。因素水平見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 復(fù)合酶的因素及水平表Tab.1 Factors and levels in quadrature orthogonal design

表2 復(fù)合酶水解鱈魚皮蛋白質(zhì)最適條件的確定Tab.2 The optimum experimental conditions of hydrulysis using compound enzyme

從表2可以看出，由木瓜蛋白酶與風(fēng)味酶組成的復(fù)合酶對鱈魚皮蛋白水解度影響的各因素主次關(guān)系為：A＞C＞D＞B，即加酶量對DH的影響最大，溫度的影響次之，而料液比的影響最小。復(fù)合酶水解的最佳組合為A2B3C2D2，即加酶量40 000 U/g，溫度 45 ℃，pH 6.0，料液比 1:2.5。

2.7 最佳酶解條件下水解時(shí)間對酶解的影響（圖6）

從圖6可以看出，在2～3.5 h之間，DH顯著增加，3.5 h之后DH的變化緩慢，可能是因?yàn)樵诿附鈩傞_始的一段時(shí)間里，底物濃度與酶活力都較高，產(chǎn)物的抑制小，有利于酶解的傳質(zhì)過程，水解度顯著增加，而3.5 h之后，隨著酶解時(shí)間的延長，由于酶的專一性，可酶解的肽鍵逐漸減少，酶活力逐漸降低，游離肽對產(chǎn)物的抑制增加，水解度變化緩慢。綜合考慮，確定酶解的最佳時(shí)間為4 h，此時(shí)的水解度可達(dá) 22.45%。

圖6 酶解時(shí)間對酶解的影響Fig.6 Effect of hydrolysis time on degree of hydrulysis

3 結(jié)論

利用木瓜蛋白酶與風(fēng)味酶組合成的復(fù)合酶對鱈魚皮蛋白進(jìn)行酶解，通過單因素試驗(yàn)以及正交試驗(yàn)，確定了最佳的酶解條件為：木瓜蛋白酶與風(fēng)味酶的復(fù)合比為3:1，加酶量為40 000 U/g，溫度為45℃，pH 6.0，料液比為 1:2.5，酶解 4 h，此時(shí)有最大水解度，可達(dá) 22.45%。

[1]王海英,宋永相,孫 謐,等.酶解鱈魚皮制備血管緊張素轉(zhuǎn)換酶制劑ACEI的研究[J].現(xiàn)代食品科技,2008,24（10）：987-988

[2]孫麗平,汪東風(fēng),張 莉,等.利用鱈魚皮蛋白制備熱反應(yīng)型肉香調(diào)味基料的研究 [J].中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào),2009,39（2）：249-250.

[3]陳 麗,李八方,趙 雪,等.可食性狹鱈魚皮明膠-殼聚糖復(fù)合膜的制備與性質(zhì)[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2009,33（4）：685-686.

[4]林 琳.魚皮膠原蛋白的制備及膠原蛋白多肽活性的研究[D].青島:中國海洋大學(xué),2006.

[5]YAMAZAKI K,TAKAS S,HARA H.Process for producing a low-molecular weight peptide composition and nutrient agent containingthe same Unite state patent 4452888[P].1984-06

[6]趙新淮,馮志彪.蛋白質(zhì)水解物水解度的測定[J].食品科學(xué),1994(11)：66-67.