黃燕平，王舒喆，鄭永平

香港理工大學(xué) 醫(yī)療科技及資訊學(xué)系，香港

基于OCT的氣沖印壓系統(tǒng)及應(yīng)用：檢測軟骨硬度變化

黃燕平，王舒喆，鄭永平

香港理工大學(xué) 醫(yī)療科技及資訊學(xué)系，香港

超聲印壓是一種廣泛用于獲得軟組織力學(xué)特性的測試方法，其特點是操作簡單，對測試樣品準(zhǔn)備要求簡單，并且可以同時獲得樣本的初始厚度和形變。在此基礎(chǔ)上，我們提出并開發(fā)了基于光干涉斷層成像（OCT）的氣沖印壓系統(tǒng)。該系統(tǒng)利用氣柱產(chǎn)生印壓作用，利用OCT完成組織形變的追蹤。相對于普通中低頻超聲印壓系統(tǒng)，氣柱操作簡易，同時OCT具有更高的成像分辨率，因此OCT氣沖系統(tǒng)在小組織例如關(guān)節(jié)軟骨測試方面具有一定的優(yōu)勢。本文描述該系統(tǒng)的組成，并評估該系統(tǒng)在檢測軟骨在兩種蛋白酶消化后硬度改變的作用。實驗取47個離體牛髕骨軟骨樣本，進(jìn)行胰蛋白酶（20個）和膠原蛋白酶（20個）消化分解（剩余7個作為參考樣本，不作處理）。軟骨力學(xué)特性用一個硬度系數(shù)表示。結(jié)果顯示經(jīng)胰蛋白酶消化后，軟骨硬度系數(shù)從(734±281) kPa下降到(230±133) kPa（p ＜ 0.001，配對 t 檢驗，下同），經(jīng)膠原蛋白酶消化后該參數(shù)從(705±286) kPa下降到(107±74) kPa（p ＜ 0.001）。實驗結(jié)果表明該系統(tǒng)可以用于軟骨力學(xué)特性的定量檢測。本文最后討論該系統(tǒng)進(jìn)一步小型化以用于活體軟骨檢測的課題。

軟骨；骨關(guān)節(jié)炎；胰蛋白酶；膠原蛋白酶；力學(xué)特性；硬度；光干涉斷層成像；氣沖印壓；小型化；內(nèi)窺鏡；超聲

0 前言

在很多組織里面，很多病變?nèi)缋w維化、水腫、腫瘤、退化往往伴隨著其力學(xué)特性的改變。在這種情況下，按摸觸診往往是醫(yī)生診斷的重要依據(jù)。但是觸診是一種定性的診斷方式，診斷很大程度依賴于操作者的經(jīng)驗，導(dǎo)致結(jié)果具有很大的主觀性，所以有必要尋求一種定量化的更加客觀評價組織力學(xué)特性改變的測量方法。彈性成像作為一種新的成像模式，可以獲得組織內(nèi)部不同地方的彈性對比度，對很多病癥的檢測具有重要的臨床價值[1]。但是假如組織的硬度變化是整體性的而不是局部的，彈性成像就會顯示出一定的局限性，這個時候測量組織的整體有效硬度對其病理的檢測更加有效。在這些方法當(dāng)中，印壓實驗是其中一種操作簡單，對測試樣本配備要求較低的測量方法，并被廣泛使用。在計算組織力學(xué)特性參數(shù)例如楊氏模量的時候，組織的初始厚度是一個比較重要的參數(shù)，特別是當(dāng)印壓頭大小跟組織初始厚度具有可比性的時候[2]。但是傳統(tǒng)印壓方法一般需要依靠另外的測量方法獲得組織的初始厚度，這給測試帶來了很大的不便性，于是有學(xué)者提出了超聲印壓的概念[3]。超聲印壓利用超聲探頭的平整面作為壓頭來對組織進(jìn)行印壓，并且可以利用超聲信號同時測得組織的 形變和厚度， 已經(jīng)成功 應(yīng)用于 例如下肢 組織硬 度[4]，肌肉訓(xùn)練效果[5]，放療后組織纖維化程度[6]，糖尿病病人足部組織病變[7]等方面的評估。國內(nèi)四川醫(yī)學(xué)科學(xué)院和重慶醫(yī)科大學(xué)的一個研究組也展開了內(nèi)窺式超聲印壓系統(tǒng)方面的研究，并把印壓實驗成功應(yīng)用在心肌的被動力學(xué)特性檢測上[8-9]。

當(dāng)在比較薄的組織中使用超聲印壓時，必須使用高頻超聲以提高空間分辨率。但是高頻超聲探頭的表面一般是凹狀的，不適合作為印壓頭使用。為了解決這個問題，我們提出了一種超聲水沖印壓系統(tǒng)，利用水射流作為工具來印壓組織，實驗證明該系統(tǒng)可行有效[10-11]。利用流體作為印壓工具同時還可以提高系統(tǒng)的測量速度，使硬度的表面成像（C 掃描）成為可能[12]。同時，流體印壓因為對所作用組織的邊界限制較小，可在一定程度上減少印壓實驗對組織的破壞性。除了用超聲作為測量形變的手段，也有研究提出用光學(xué)的方法配合水沖印壓來獲得組織的硬度[13]。但是我們注意到，如果在臨床使用當(dāng)中，使用液體射流印壓的一個不方便的地方就是需要特殊處理這些液體（如生理鹽水），需要特別的設(shè)計例如單獨的通道來搜集并排出這些液體。鑒于此項缺點，本文提出另外一個流體印壓方法：氣體射流印壓配合OCT成像技術(shù)來完成測量組織的力學(xué)特性。OCT是近年發(fā)展較快的一種可以用在生物學(xué)進(jìn)行成像的方法，其工作原理接近超聲脈沖回波方法，但是具有很高的空間分辨率，所以適合作為一種新的成像方式用在小型組織例如眼球結(jié)構(gòu)、軟骨等的研究上。

骨關(guān)節(jié)炎是常見特別是在老年人當(dāng)中更加普遍的一種關(guān)節(jié)疾病，嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量，發(fā)展到中后期可能會導(dǎo)致病人的殘疾，給家庭和社會帶來很大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。骨關(guān)節(jié)炎中最重要的一個變化就是軟骨的退化，傳統(tǒng)的X光只能檢測到后期病變，這種后期的病變現(xiàn)在還沒有藥物可以治療，普通藥物的目標(biāo)是盡量降低病人的痛楚或者不適感。在早期軟骨退化的治療方面，最新研究顯示骨性關(guān)節(jié)炎疾病改善藥物有很好的發(fā)展前景[14-15]，但是這個治療的前提是必須盡早檢測出軟骨的退化，盡早治療。另一方面，經(jīng)過手術(shù)修復(fù)后的軟骨質(zhì)量也需要很好的手段來評估修復(fù)的效果。經(jīng)過手術(shù)修復(fù)后的軟骨表面很可能看起來跟正常的一樣，但是在質(zhì)量方面例如負(fù)重性卻可能不是很令人滿意，這同樣也需要一種定量化的客觀手段來評價軟骨的完整度。

研究顯示 OCT不僅可以定性分析軟骨在病變當(dāng)中微小的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化（也叫“光學(xué)活組織檢查”），還可以定量獲得軟骨厚度、折射系數(shù)[16]、光學(xué)反射系數(shù)[17]和表面粗糙度[17]等一系列參數(shù)來客觀分析軟骨狀態(tài)的改變，在軟骨方面的研究前景廣泛。本文主要向讀者介紹一種基于 OCT 的氣沖印壓系統(tǒng)，并將該系統(tǒng)應(yīng)用在軟骨的測試上面，評估該系統(tǒng)在檢測軟骨因退化而產(chǎn)生的硬度變化的作用，并探討了其結(jié)合關(guān)節(jié)內(nèi)窺鏡[18]用于真正臨床實驗的進(jìn)一步的設(shè)計。

1 材料和方法

1.1 系統(tǒng)結(jié)構(gòu)組成

圖1 （a）基于OCT的氣沖印壓系統(tǒng)核心部分結(jié)構(gòu)和（b）實物圖

本實驗所采用的基于OCT的氣沖印壓系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)圖可以參照圖1。實驗 OCT 系統(tǒng)（清華大學(xué)深圳研究生院光學(xué)成像和檢測實驗室研制）光源中心波長 1310nm，-3dB 帶寬為 50nm，輸出功率為 5mW。此系統(tǒng)理論空間分辨率為18μm，在不透明組織的探測深度為 2～3mm。為測量方便，該系統(tǒng)有紅光引導(dǎo)探測點。我們在 OCT 信號出口處裝上一個噴口，用來產(chǎn)生氣柱，噴口上面有個透明玻璃隔離板既可以用來阻止氣體進(jìn)入 OCT部分，又可以讓紅外光通過。紅外光聚焦在噴口下面5mm處的地方，并把樣本放置在此處。一個電壓控制比例閥開關(guān)（ITV 1030-311L-Q，日本東京 SMC 公司）用來控制產(chǎn)生氣體的氣壓大小，該比例閥的氣壓控制范圍是 0.5MPa（5 個大氣壓），并自帶氣壓壓強(qiáng)反饋信號，用來獲得實際氣流的氣壓大小。本實驗氣體就是普通的空氣，來自學(xué)校自備的供氣系統(tǒng)。為了使氣柱更加平穩(wěn)，一條直徑為 1mm 的氣管安裝在噴口的出口，用來引導(dǎo)噴出的氣體。

圖2 用于OCT氣沖印壓系統(tǒng)的數(shù)據(jù)采集流程圖

氣沖印壓系統(tǒng)的數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)如圖2所示。一個用Microsoft VC++ 編寫的程序（“wave”）用于控制系統(tǒng)、實時顯示和保存數(shù)據(jù)。比例閥開關(guān)控制電壓由數(shù)據(jù)采集卡（PCI 6024E, 美國奧斯汀 National Instrument公司 )根據(jù)預(yù)編寫的波形信號發(fā)出。A 模 OCT 信號和氣壓信號同步的采樣頻率為 16Hz。對于 A 模 OCT 信號，信號長度為 7500 點，經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)厚度載玻片校正，在空氣中每點對應(yīng)的物理長度為0.43μm。氣壓信號和印壓力的對應(yīng)關(guān)系也由實驗進(jìn)行確定。實驗當(dāng)中，A模OCT數(shù)據(jù)可以用來觀察樣本表面反射的變化，此變化會被當(dāng)作樣本的形變量進(jìn)行處理（如圖3 所示）。利用相關(guān)性追蹤獲得的移動點數(shù)再乘上每點所代表的實際物理長度，就是印壓過程當(dāng)中組織的形變量。

圖3 追蹤獲取軟骨形變信號圖實驗中，追蹤部分會隨著氣柱的作用前后移動，表示升壓和減壓的過程

1.2 軟骨樣本測試

我們利用從市場獲得的離體牛髕骨軟骨樣本來進(jìn)行實驗，驗證該系統(tǒng)測試軟骨力學(xué)特性的可行性和可靠性。具體的樣本制備過程可以參考以前的相關(guān)研究[19]，這里只給出一個大致的流程。在髕骨上面鑿出直徑為 6.35mm、厚度約5mm連同下面的骨頭在一起的柱形圓塊，用一個特殊的固定裝置固定測試的軟骨樣本（如圖4所示）。該裝置將軟骨放置在中心的柱形圓孔里面，旁邊用螺絲固定，以保證實驗中樣本沒有整體的移動。本實驗測試了47個軟骨樣本，其中 7個屬于沒有處理的樣本，只用來進(jìn)行染色實驗，20個樣本屬于胰蛋白酶消化組，另外20個屬于膠原蛋白酶消化組。胰蛋白酶主要用來消化軟骨里面的蛋白聚糖（對部分膠原蛋白也有影響）[20]，膠原蛋白酶（類型 2）用來消化軟骨里面的膠原蛋白[21]。實驗使用 0.25% 的胰蛋白酶 -EDTA消化液（GIBCO，美國加州 Invitrogen 公司）和 30 單位 /mL（GIBCO，美國加州 Invitrogen 公司）的膠原蛋白酶溶液來消化分解軟骨模擬軟骨的退化。胰蛋白酶消化過程讓軟骨在 37℃下浸泡在溶液里面水解 4h，膠原蛋白酶消化讓軟骨在 37℃下浸于溶液中浸泡 24h。在處理之后，軟骨在 0.9%的生理鹽水中沖洗放置最少 1.5h 后再接受測量。我們將對樣本在酶消化之前和之后的結(jié)果經(jīng)行對照。實驗都在室溫下 (24±1)℃進(jìn)行。完成所有力學(xué)測試后，7 個沒有經(jīng)過酶處理的軟骨，7個經(jīng)過胰蛋白酶處理的和7個經(jīng)過膠原蛋白酶處理的軟骨樣本被送去進(jìn)行番紅 O/固綠染色實驗。為了獲得軟骨的厚度，實驗中還使用了 55MHz超聲系統(tǒng)（RMV708 探頭，Vevo770，加拿大多倫多 VisualSonics 公司）對軟骨進(jìn)行超聲影像實驗，厚度的測試基于傳播時間和聲速的乘積[19]。

圖4 用于固定軟骨樣本的裝置

測量在空氣當(dāng)中進(jìn)行。我們將軟骨放置在固定裝置里面，氣柱作用在軟骨的中心點。軟骨的固定以獲得最大的表面反射波作為標(biāo)準(zhǔn)，此時光柱和氣柱被認(rèn)為是垂直于軟骨表面。實驗開始之前我們用 0.04N 的力預(yù)壓軟骨 3s 然后將壓力在 6s 之內(nèi)加到 0.1N 左右，然后觀察軟骨的形變。每個軟骨總共進(jìn)行3次測試，3次的平均值作為代表樣本的最終結(jié)果。每兩次印壓之間軟骨放置在 0.9% 的生理鹽水里面至少 0.5h 讓軟骨徹底恢復(fù)。消化之前之后使用同樣實驗設(shè)置和方法。為了進(jìn)行對比實驗，樣本也在標(biāo)準(zhǔn)力學(xué)測量儀（Instron 5569, 美國麻省 Instron 公司）上面進(jìn)行印壓測試。測試采取跟氣沖印壓類似的實驗條件。

我們用公式 (1)定義的硬度系數(shù)來表達(dá)軟骨的彈性特征：

此公式中F是樣本受到的壓力，d是軟骨形變，D是軟骨初始厚度，S是作用面積。本研究假設(shè)氣沖力作用在氣柱直徑大小的面積上，也就是說氣柱作用面積是直徑為1mm的圓。在用線性回歸獲取參數(shù)的時候，我們只用了上升階段，最大相對形變是初始厚度的3%。

1.3 統(tǒng)計分析和染色實驗

對軟骨硬度系數(shù)用配對t檢驗對比消化之前和之后的結(jié)果，用 SPSS 軟件（15.0 版本，美國芝加哥 SPSS 公司）完成，檢測后 p ＜ 0.001 作為臨界點用來判斷參數(shù)是否具有顯著變化。 實驗對 21 個樣本進(jìn)行了番紅 O/固綠染色處理，然后在光學(xué)顯微鏡下觀察[19]。那些被染成紅色的部分就是代表蛋白聚糖存在的地方，綠色的部分代表蛋白聚糖已經(jīng)被消化分解。

2 實驗結(jié)果和討論

圖5 軟骨硬度系數(shù)經(jīng)過兩種蛋白酶消化前后的硬度系數(shù)對照

圖6 氣沖印壓和Instron印壓的硬度系數(shù)的相關(guān)性結(jié)果

圖7 典型染色結(jié)果（a）沒有經(jīng)過酶處理的軟骨；（b）經(jīng)過胰蛋白酶消化后軟骨，蛋白聚糖基本被分解 ；（c）經(jīng)過膠原蛋白酶消化后軟骨，部分蛋白聚糖被分解。

成功從所有軟骨上面測得硬度系數(shù)。經(jīng)過胰蛋白酶消化 后， 軟 骨 系 數(shù) 從 (734±281)kPa 顯 著 降 到 了 (230±133) kPa（p ＜ 0.001），下降的幅度為 (63±24)% ；經(jīng)過膠原蛋白酶消化后，該參數(shù)從 (705±286) kPa 顯著降到了 (107±74) kPa（p ＜ 0.001）， 下 降 的 幅 度 為 (84±9)%（ 如 圖5）。 跟Instron 測量的系數(shù)進(jìn)行比較，結(jié)果具有很強(qiáng)的相關(guān)性（r = 0.83， p ＜ 0.005，Pearson 相關(guān)系數(shù)，如圖6），Instron 印壓測量結(jié)果顯示軟骨在經(jīng)過胰蛋白酶和膠原蛋白酶分解后，硬度系數(shù)分別降低了 (66±23)% 和 (87±15)%。所有這些結(jié)果說明兩種儀器的測量結(jié)果具有很強(qiáng)的可比性，驗證了氣沖印壓系統(tǒng)的操作可行性。圖7顯示了典型的正常軟骨和經(jīng)過兩種蛋白酶消化之后的軟骨進(jìn)行番紅染色實驗的結(jié)果。經(jīng)過胰蛋白酶消化之后，軟骨當(dāng)中的蛋白聚糖被分解完全，附著在蛋白聚糖上面的固定電荷密度減少，壓縮過程中互斥作用減小導(dǎo)致軟骨硬度大幅度下降；膠原蛋白酶雖然只對膠原蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行作用，但是因為膠原蛋白的分解，形成許多小孔，吸附在這個網(wǎng)絡(luò)上的蛋白聚糖也會隨之流出，這可以從圖7（c）中看出，所以，膠原蛋白酶分解也會導(dǎo)致軟骨硬度的大幅下降。實驗結(jié)果證明基于 OCT 的氣沖印壓系統(tǒng)能成功測量軟骨的硬度和其在兩種蛋白酶消化之后的改變。顯然當(dāng)前的實驗還有一些不足的地方，例如OCT信號受樣本表面變化影響比較大，導(dǎo)致表面反射信號部分發(fā)生去相關(guān)，給形變的追蹤獲取帶來一定的噪聲；當(dāng)前OCT 系統(tǒng)也不能測得軟骨的厚度，但是通過對 OCT系統(tǒng)設(shè)計方面的改進(jìn)，已經(jīng)證明利用 OCT 進(jìn)行軟骨厚度的測量是可行的[22]。

3 結(jié)論和展望

本文主要介紹了一種基于OCT的氣沖印壓系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)組成，然后通過檢測軟骨的退化，證明該系統(tǒng)可以用來評估離體軟骨樣本的力學(xué)特性。因為力學(xué)特性的改變是軟骨早期退化或者修復(fù)質(zhì)量不佳的重要表現(xiàn)，所以本文提出的氣沖印壓系統(tǒng)在研究軟骨力學(xué)及光學(xué)特性方面具有很廣闊的發(fā)展前景。接下去，我們將會結(jié)合關(guān)節(jié)內(nèi)鏡技術(shù)，將這個系統(tǒng)的光學(xué)部件小型化后安裝在內(nèi)窺鏡里面，這樣結(jié)合微創(chuàng)關(guān)節(jié)鏡手術(shù)，我們就可以以客觀的手段來評估活體軟骨在自然退化當(dāng)中的各項性質(zhì)的改變或者手術(shù)修復(fù)后軟骨質(zhì)量的恢復(fù)情況。

致謝

作者感謝張忠偉在準(zhǔn)備軟骨樣本當(dāng)中的大力幫助。本研究部分資助來自于香港研究資助局（RGC，PolyU5318/05E, PolyU5245/03E)和香港理工大學(xué)（J-BB69）。

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OCT-based Air-jet Indentation System and Applications: Detection of Change of Stiffness in Articular Cartilage

HUANG Yan-ping, WANG Shu-zhe, ZHENG Yong-ping
Department of Health Technology and Informatics, The Hong Kong Polytechnic University, Hong Kong, China

Ultrasound indentation is widely adopted as a mechanical testing method to measure the mechanical properties of soft tissues. Advantages of this technique include an operation ease and less requirements for specimen preparation before testing, with acquisitions of both deformation and initial thickness of the soft tissue. Based on this technique, we have further proposed and developed an OCT-based air-jet indentation system, which utilizes the air-jet to indent the tissue and OCT to obtain the deformation. Compared to middle to low frequency ultrasound in the ultrasound indentation system, OCT has a better spatial resolution and thus it may be advantageous to use it for studying small tissues such as the articular cartilage. In this study, we described the construction of the OCT-based air-jet indentation system and demonstrated its usefulness for detecting the change of stiffness in cartilage before and after degeneration artificially induced by enzyme digestions. Forty-seven bovine patellar cartilage disks were tested with 20 treated with trypsin, 20 by collagenase and the last 7 serving as control without enzyme treatment. A stiffness coefficient was used to represent the cartilage elasticity. After digestion, the stiffness coefficient decreased from (734±281) kPa to (230±133) kPa in the trypsin group (p＜0.001, paired t-test) and from (705±286) kPa to (107±74) kPa in the collagenase group (p＜0.001, paired t-test), respectively. Results of the current study demonstrated that the OCT-based air-jet indentation can be a useful tool to quantitatively assess the mechanical properties of articular cartilage. The development of a further miniaturized probe suitable for arthroscopic applications to articular cartilage in vivo is discussed at the end of this paper.

articular cartilage; osteoarthritis (OA); trypsin; collagenase; mechanical properties; stiffness; optical coherence tomography (OCT); air-jet indentation; miniaturization; arthroscopy; ultrasound

R445.1

B

10.3969/j.issn.1674-1633.2011.01.005

1674-1633(2011)01-0017-05

2010-11-01

香港研究資助局（RGC，PolyU5318/05E, PolyU5245/ 03E)和香港理工大學(xué)（J-BB69）支持。

鄭永平

通訊作者郵箱：ypzheng@ieee．org