陳 春 張淑麗

(1 青島市第八人民醫(yī)院中藥房，山東 青島266100；2 青島市膠州中心醫(yī)院中藥房，山東 青島266300)

紅花、川牛膝、丹參、女貞子、枸杞、甘草、肉蓯蓉、淫羊藿、補骨脂、菟絲子是臨床常用婦科用種中草藥，據(jù)文獻資料報道，它們均含有雌激素（phytoestrogen），由于動物雌激素替代療法在治療婦科疾病，如更年期綜合征的同時，可導致乳腺癌、子宮內膜癌等婦科腫瘤發(fā)生的危險性增加，所以近幾年來已經更多地被植物雌激素代替[1]。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 試劑

SC培養(yǎng)基（作為酵母生長的培養(yǎng)基；17β-雌二醇（ sigma））；破壁酶lyticase（sigma）；β-巰基乙醇（sigma）；酶反應底物o-nitrophenol-β-D-galactopyranoside；二甲基亞砜（DMSO）。

1.1.2 中藥材

紅花、女貞子、丹參、甘草、川牛膝、肉蓯蓉、枸杞、補骨脂、淫羊藿、菟絲子從同仁堂中藥飲片公司購得。產地分別為：四川、湖南、江蘇等地。

1.1.3 儀器

721型分光光度計；電熱恒溫干烘箱；高速冷凍離心機（Heraeus）；全溫振蕩培養(yǎng)器；酶標板振蕩器（Lab-line instrument，Inc.）；TECAN GENIOS酶標儀。

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備

將上述10種中藥材先用水煎煮兩次，將提取液用75%的乙醇醇沉24h，過濾，濾液用旋轉蒸發(fā)儀濃縮得浸膏，用二甲基亞砜溶解浸膏即得測試樣品。將樣品按照100、10、1、0.1、0.01和0.001mg/mL濃度進行稀釋制樣。加酶反應液的制備：29.7μL β-mercaptoethanol、110μL triton X-100、22mg ONPG、726μL lyticase加入到11mL磷酸緩沖液中，混勻即得。終止液的制備：配制1mol/L Na2CO3溶液作為終止液。

1.2.2 轉基因酵母法測定10種藥材的雌激素活性

1.2.2.1 工作液的制備

將轉基因酵母（含β-半乳糖苷酶報告基因）和含有雌激素受體基因的菌種混合均勻后，置于液體培養(yǎng)基中，保持30℃恒溫，于搖床震搖過夜培養(yǎng)。當稀釋10倍后，其在600nm處測得的紫外吸收值為0.15～0.2時，用10μM的CuSO4培養(yǎng)基稀釋酵母菌液到OD600=0.5，即得工作液。

1.2.2.2 測試樣品的制備

將每個樣品取5μL和995μL酵母菌液混合置于離心管中，每個樣品吸取100μL置于96孔板中，每個樣品測試三次。在30℃恒溫搖床中震搖暴露2h，測定OD595。加酶反應液100μL/wel，l待溶液變黃后，加終止液100μL/well，用TECAN酶標儀測定OD420。

1.2.2.3 樣品測定

每次測定均用17β-雌二醇（E2）作陽性對照。

1.2.3 β-半乳糖苷酶活性計算

β-半乳糖苷酶活性u的計算公式如下:

U為酶活力，A595表示酵母體系的吸光度，A420為酵母反應體系的吸光度，50表示E2反應時間（min），T表示反應時間。

1.2.4 EC50計算方法

用Marquardt-Levenberg algorithm （Sigmaplot 4.0，SPSSInc.，Chicago，IL，USA）軟件計算樣品及E2的EC50[（產生最大酶活一半時樣品對應的質量濃度（g/L）]，計算方法如下：

X為樣品質量濃度（g/L），Y為β-半乳糖苷酶活性，C為線性部分斜率，A為β-半乳糖苷酶最大響應活性，D為最低檢測限。

2 測定結果

2.1 10種藥材水煎提取樣品的雌激素活性指標見表1。

從表1數(shù)據(jù)中可以看出，紅花、川牛膝、丹參、淫羊藿、補骨脂、菟絲子6種中藥的雌激素活性較甘草、枸杞、肉蓯蓉、女貞子的雌激素活性高。

表1 10種藥材水煎提取樣品的雌激素活性指標

3 討 論

植物雌激素較動物雌激素在用于雌激素替代治療中有明顯的優(yōu)勢，尤其是可明顯降低治療過程中產生的一系列并發(fā)癥如：高血壓、乳腺癌、高血凝、水腫，而受到了越來越多研究人員的關注。文獻報道， 紅花、丹參、川牛膝、女貞子、甘草、枸杞、肉蓯蓉、補骨脂、淫羊藿、菟絲子均具有激素樣活性[2,3]。為了對這10種中藥材的雌激素活性成分進行比較，我們采用轉基因酵母法[4,5]測定10種藥材的雌激素活性，比較10中藥材的雌性激素活性高低，為臨床用藥提供參考。本組資料顯示，紅花、川牛膝、丹參、淫羊藿、補骨脂、菟絲子6種中藥的雌激素活性較甘草、枸杞、肉蓯蓉、女貞子的雌激素活性高。

[1]張炎,胡婭莉.植物雌激素與激素替代治療的比較[J].國外醫(yī)學婦幼保健分冊,2005,16(4): 222.

[2]國家醫(yī)藥管理局中草藥情報中心站.植物藥有效成分手冊[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1986:182-183.

[3]張晚暉,劉素香,徐敏.植物雌激素與中藥研究[J].中藥新藥與臨床藥理,2002,13(4): 261-264.

[4]何世華,梁增輝,晁福寰.環(huán)境雌激素測評方法研究進展[J].中國公共衛(wèi)生,2002,18(10): 1254-1256.

[5]Balmelli-GallacchiP,SchoumacherF,Liu JW,et al.A yeast-basedbioassay for the determination of functional and non-functionalestrogen receptors[J].BBA-Biochimica etBiophysica Acta,1998,386(1): 121-131.