韓 香,黃曉丹,薛慧婷,黃 曙,張發(fā)明,季國(guó)忠

0 引 言

肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全球最常見的惡性腫瘤之一,在惡性腫瘤其致死率中占第 3位[1]。HCC初期癥狀不明顯,早期診斷率較低,5年生存率小于 5%,往往確診時(shí)多數(shù)已發(fā)展為中晚期,發(fā)生遠(yuǎn)處擴(kuò)散轉(zhuǎn)移[2]。因此,研究 HCC侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生機(jī)制,對(duì)改善肝癌患者預(yù)后、延長(zhǎng)患者生存期,具有重要的意義。

腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移受多種因素的調(diào)控和影響,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming grow th factor-β,TGF-β)-Smad信號(hào)通路是其中一種重要的調(diào)控因素,Smad4分子是該信號(hào)通路中的關(guān)鍵效應(yīng)分子,它與受體型的 Smad結(jié)合形成異源復(fù)合物,從而調(diào)控通路下游靶基因的表達(dá)[3-4]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)Smad4與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3],在結(jié)腸癌、前列腺癌中 Smad4都有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用[5-6],但其在肝癌轉(zhuǎn)移中的作用及其機(jī)制的研究報(bào)道卻較少。我們?cè)隗w外培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞 SMMC-7721,通過(guò)構(gòu)建Smad4的 RNAi慢病毒載體,經(jīng)包裝、濃縮后感染肝癌細(xì)胞,驗(yàn)證 Smad4的干擾效率,觀察干擾 Smad4表達(dá)后肝癌細(xì)胞遷移能力的變化,進(jìn)一步通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白 fascin和 cortactin表達(dá)的改變,探討 Smad4對(duì)肝癌細(xì)胞遷移的影響及可能的分子機(jī)制,以期為進(jìn)一步提高肝癌患者的治療效果、改善預(yù)后提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細(xì)胞株 SMMC-7721和人胚腎細(xì)胞株 293T購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所;慢病毒載體購(gòu)自美國(guó)Tronolab公司;鼠抗人 Smad4單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司;鼠抗人 fascin單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Upstate公司;鼠抗人 cortactin單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司;小鼠抗大鼠 β-actin單克隆抗體和 HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗購(gòu)自武漢博士德公司;Matrigel膠購(gòu)自美國(guó) BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞株 SMMC-7721和人胚腎細(xì)胞株 293T,均以含 10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基,于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),胰酶消化、傳代,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 Smad4的 RNAi慢病毒載體的構(gòu)建 根據(jù)Smad4基因序列,設(shè)計(jì)、合成 16對(duì)針對(duì) Smad4基因的 RNA干擾序列,經(jīng)退火形成雙鏈 DNA,與雙酶切后的 pMAGIC1.0載體連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5a,挑取陽(yáng)性克隆行 PCR鑒定。

1.2.3 慢病毒載體的包裝和濃縮 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 293T細(xì)胞(密度為 3 ×105個(gè) /ml)培養(yǎng),細(xì)胞匯合達(dá) 70%～80%時(shí)轉(zhuǎn)染。將慢病毒質(zhì)粒溶液和病毒轉(zhuǎn)染試劑溶液混合,加入培養(yǎng)皿中并混勻,37℃、3%CO2和 95%相對(duì)濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。8h后更換新鮮培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng) 24h后收集上清液,24h后再次收集上清液。將收取的上清液中加入 5 mol/L NaCl溶液至終濃度為 0.15mol/L和 20%體積的聚乙二醇 8000,4℃振蕩過(guò)夜,4℃、10000×g離心 30 min后,棄去上清液加入適量OMEM溶解病毒沉淀,封口 4℃保存。

1.2.4 慢病毒滴度測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 293T細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后稀釋至 1×105個(gè)/ml,加入 96孔板(100μl/孔),37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取 10個(gè)eppendorf管,每管中加入 90μl培養(yǎng)液,加入 10μl病毒顆粒于第 1管,混勻,從第 1管中吸取 10μl加入下一管,混勻,依次稀釋病毒顆粒至第 10管。吸取 96孔板中原有的培養(yǎng)液,加入含稀釋號(hào)的病毒液。24h后每孔再加入含抗生素的 100μl完全培養(yǎng)液,37℃孵育 24h后,計(jì)算病毒滴度。

1.2.5 慢病毒感染 SMMC-7721細(xì)胞 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 SMMC-7721細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后稀釋至 3×104個(gè) /ml,加入 96孔板(90μl/孔)。當(dāng)細(xì)胞匯合率為 50%時(shí)進(jìn)行感染,并加入 5μg/μl的聚凝胺以增加感染效率。12 h后棄去上清,加入 100μl/孔的完全培養(yǎng)液。感染后次日加入抗生素進(jìn)行篩選,觀察細(xì)胞生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。

1.2.6 Western blot檢測(cè) Smad4、fascin和 cortactin蛋白的表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白,BCA法測(cè)定各組蛋白濃度。根據(jù)濃度上樣行電泳后轉(zhuǎn)膜至 PVDF膜上,5%脫脂奶粉的 TBST封閉 1h,加一抗(β-actin 1∶500、Smad4 1∶200、fascin 1∶500、cortactin 1∶500)4℃雜交過(guò)夜,TBST漂洗,加二抗(1∶2000)室溫孵育 2h,TBST漂洗,化學(xué)發(fā)光試劑檢測(cè)蛋白條帶,測(cè)定各條帶積分光密度值,定量分析。

1.2.7 細(xì)胞劃痕 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)后稀釋至 2×105個(gè)/m l,接種于 6孔板,待細(xì)胞基本長(zhǎng)滿后,用 200μl槍頭沿各孔底部中央劃一直線,PBS洗滌 3次,加入無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng),0、12、24、48h后于倒置顯微鏡下觀察劃痕區(qū)細(xì)胞的遷移情況并拍照。

1.2.8 3D培養(yǎng) 將 Matrigel膠加入 96孔板(35 μl/孔),待其覆蓋均勻后 37℃孵育 45min。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)后稀釋至 2×104個(gè)/m l,加入之前的 96孔板(35μl/孔),37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)連續(xù)培養(yǎng) 4d后倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù) 3次以上,用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,定量結(jié)果采用均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示,多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析,兩兩組間比較采用組間 q檢驗(yàn),以 P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 pMAGIC1.0載體質(zhì)粒的酶切 載體質(zhì)粒pMAGIC1.0經(jīng) AgeⅠ和 EcoRⅠ雙酶切的結(jié)果,見圖1。

2.2 陽(yáng)性克隆 PCR鑒定 以連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后形成的陽(yáng)性克隆為模板,行 PCR擴(kuò)增后,連接入雙鏈片段的陽(yáng)性克隆PCR片段大小為 343bp,如圖2所示。PCR結(jié)果與預(yù)測(cè)相符,說(shuō)明已經(jīng)將 RNAi的雙鏈連接到慢病毒載體上,Smad4的 RNAi慢病毒載體質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3 慢病毒載體的包裝和滴度測(cè)定 將慢病毒質(zhì)粒溶液與慢病毒轉(zhuǎn)染試劑混合共同轉(zhuǎn)染 293T細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后 48h細(xì)胞生長(zhǎng)良好,病毒濃縮后測(cè)定滴度為2×108TU/m l,表明病毒包裝、濃縮成功。

2.4 慢病毒感染 SMMC-7721細(xì)胞后 Smad4蛋白的表達(dá) Western blot結(jié)果見圖3。與 SMMC-7721組(1.17±0.06)及 RNAi-NC組(1.20±0.02)相比,RNAi-Smad4-2組(0.12±0.02)和 RNAi-Smad4-12組(0.10±0.01)細(xì)胞中 Smad4蛋白出現(xiàn)明顯的低表達(dá)(P＜0.05);而 SMMC-7721組和 RNAi-NC組細(xì)胞間比較,Smad4蛋白的表達(dá)無(wú)明顯差異。這說(shuō)明慢病毒感染 SMMC-7721細(xì)胞后能有效的抑制Smad4蛋白的表達(dá)。

圖1 p MAGIC 1.0載體質(zhì)粒 AgeⅠ/EcoRⅠ雙酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖Figure 1 Restriction map of p lasm id by AgeⅠ /EcoRⅠ

圖2 陽(yáng)性克隆的瓊脂糖凝膠電泳圖Figure 2 Electrophoretic profile of positive clones

圖3 慢病毒感染 SMMC-7721細(xì)胞后 Smad4蛋白的表達(dá)Figure 3 Expression of Sm ad 4 protein in SMMC-7721 cells after lentivirus infection

2.5 低表達(dá) Smad4后對(duì) SMMC-7721細(xì)胞遷移能力的影響 細(xì)胞劃痕 12 h后,SMMC-7721組和RNAi-NC組細(xì)胞的劃痕仍較明顯,并且隨觀察時(shí)間的延長(zhǎng),其劃痕愈合速度明顯慢于RNAi-Smad4-2組和 RNAi-Smad4-12組細(xì)胞,見圖4。3D培養(yǎng)環(huán)境下,RNAi-Smad4-2組和 RNAi-Smad4-12組細(xì)胞邊緣逐漸不規(guī)則,向周圍凝膠滲透;而 SMMC-7721組和RNAi-NC組細(xì)胞仍呈邊緣完整的類球形形態(tài),見圖5。細(xì)胞劃痕和 3D培養(yǎng)的結(jié)果顯示,低表達(dá) Smad4后 SMMC-7721細(xì)胞遷移能力明顯增強(qiáng)。

圖4 低表達(dá) Smad4后SMMC-7721細(xì)胞遷移能力的變化-細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)(×200)Figure 4 Change of SMMC-7721 cells migration after Smad 4 knock-down in wound-healing experiment(×200)

2.6 低表達(dá) Smad4后對(duì) fascin和 cortactin蛋白表達(dá)的影響 相較于 SMMC-7721組(fascin:0.33±0.07,cortactin:0.13±0.02)和 RNAi-NC組(fascin:0.50±0.10,cortactin:0.13±0.01),RNAi-Smad4-2組(fascin:0.72±0.11,cortactin:0.53±0.07)和RNAi-Smad4-12組 (fascin:0.83±0.11,cortactin:0.36±0.05)細(xì)胞中的 fascin(圖6)和 cortactin(圖7)蛋白表達(dá)量均顯著增加(P＜0.05)。cortactin蛋白在 SMMC-7721組和 RNAi-NC組細(xì)胞中表達(dá)相仿,無(wú)顯著差異。

圖5 低表達(dá)Smad4后SMMC-7721細(xì)胞遷移力的變化-3D培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)(×400)Figure 5 Change of SMMC-7721 cells migration after Smad 4 knock-down in a 3-dimensiona l Matrigel(×400)

圖6 低表達(dá)Smad4后細(xì)胞中fascin蛋白的表達(dá)變化Figure 6 Change of fascin p rotein expression in cells after Smad 4 knock-down

圖7 低表達(dá)Smad4后細(xì)胞中cortactin蛋白的表達(dá)變化Figure 7 Change of cortactin protein exp ression in cells a fter Smad 4 knock-dow n

3 討 論

腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的多步驟的過(guò)程,受到多種因素的精密調(diào)控[7-8]。在這些眾多調(diào)控因素的研究中,Smad4分子的研究越來(lái)越受到重視。Smad4分子是 TGF-β-Smad信號(hào)通路中的關(guān)鍵應(yīng)答分子,處于 TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的中樞地位,它能夠參與調(diào)控多種下游靶基因的表達(dá)[4]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn) Smad4與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān):Smad4在胰腺癌、結(jié)腸癌等腫瘤中存在表達(dá)缺失或突變,并且其低表達(dá)與這些腫瘤的不良預(yù)后[9-11]、轉(zhuǎn)移[5-6,12]密切相關(guān)。雖然 Smad4在這些腫瘤中得到了廣泛的研究,但其在肝癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中的研究卻很少。

在本實(shí)驗(yàn)中,我們以肝癌細(xì)胞 SMMC-7721為模型,觀察 Smad4對(duì)肝癌細(xì)胞遷移能力的影響,并探討可能的機(jī)制。為了觀察 Smad4在肝癌細(xì)胞遷移中作用,我們利用 RNAi技術(shù)[13],構(gòu)建了針對(duì)Smad4的 RNAi慢病毒載體,使 Smad4低表達(dá)。慢病毒載體的陽(yáng)性克隆 PCR結(jié)果顯示 Smad4的干擾序列正確連接入慢病毒載體,表明 Smad4的 RNAi慢病毒載體構(gòu)建成功。將構(gòu)建成功的慢病毒載體包裝、濃縮、感染肝癌細(xì)胞 SMMC-7721后發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞中 Smad4蛋白的表達(dá)顯著降低。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與對(duì)照組細(xì)胞相比,低表達(dá) Smad4后肝癌細(xì)胞的劃痕愈合速度加快,并且隨著觀察時(shí)間延長(zhǎng),愈合速度越快;在 3D培養(yǎng)條件下,低表達(dá) Smad4后肝癌細(xì)胞邊緣逐漸不規(guī)則,向周圍凝膠穿透,而對(duì)照組細(xì)胞仍呈類圓形的細(xì)胞形態(tài),細(xì)胞邊緣完好。上述的研究結(jié)果表明,對(duì)于體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞 SMMC-7721,低表達(dá) Smad4可以提高肝癌細(xì)胞的遷移能力。而我們前期通過(guò)對(duì)肝癌患者臨床組織學(xué)標(biāo)本的檢測(cè)研究也發(fā)現(xiàn),肝癌組織中 Smad4蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率要明顯低于癌旁組織[14],并且 Smad4的低表達(dá)與肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān),本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果與其相符。這些結(jié)果都提示 Smad4與肝癌的侵襲、轉(zhuǎn)移的過(guò)程相關(guān),但其相關(guān)的機(jī)制卻還一直不明。

腫瘤細(xì)胞的遷移是腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ),受到多種因素的調(diào)控,其中腫瘤細(xì)胞自身的運(yùn)動(dòng)能力至關(guān)重要[15]。國(guó)外的研究發(fā)現(xiàn)具有轉(zhuǎn)移潛能的大鼠前列腺癌細(xì)胞中,其與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)有關(guān)的基因表達(dá)發(fā)生改變[16];Lewis-Wambi等[17]研究乳腺癌細(xì)胞時(shí)也發(fā)現(xiàn)了與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)有關(guān)基因的表達(dá)變化;更有意義的是,干擾胰腺癌細(xì)胞 Smad4的表達(dá)后,發(fā)現(xiàn)其下游多種調(diào)控細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的基因表達(dá)也發(fā)生了改變[18]。這些研究提示 Smad4對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移過(guò)程的作用可能與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的改變相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞不僅呈現(xiàn)出變形蟲樣的運(yùn)動(dòng),而且其細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)多種骨架蛋白調(diào)控分子的上調(diào)[19]。Zhu等[20]研究也證實(shí)在運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)的結(jié)腸癌細(xì)胞中,多種細(xì)胞骨架相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生改變。本實(shí)驗(yàn)中擬探討的蛋白 fascin和 cortactin,就是 2種重要的細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白,參與維持細(xì)胞的骨架結(jié)構(gòu),影響細(xì)胞的粘連性能,調(diào)控細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力[21-23]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),fascin和 cortactin蛋白與結(jié)腸癌[24]、前列腺癌[25]、胃癌[26]等多種腫瘤的生物學(xué)行為密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中,我們利用 RNA干擾技術(shù)將肝癌細(xì)胞中 Smad4低表達(dá)后發(fā)現(xiàn),細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白 fascin和 cortactin的表達(dá)量明顯上調(diào),提示低表達(dá) Smad4后可以通過(guò)上調(diào)下游靶分子 fascin和 cortactin的表達(dá),改變肝癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力,從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明 Smad4的低表達(dá)能促進(jìn)肝癌細(xì)胞 SMMC-7721的遷移能力,并且其作用的機(jī)制可能與 Smad4低表達(dá)后上調(diào)細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白 fascin和 cortactin的表達(dá),進(jìn)而改變細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力有關(guān),但其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究明確。

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