張興虎,萬文輝,齊玉琴,黃 方,范振芳,錢曉明
DC是已知體內功能最強的抗原提呈細胞,也是唯一能在體內直接激活初始(na?ve)T細胞,促進 T輔助細胞和細胞毒性 T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)的生成,并能促進 B細胞生成抗體的免疫細胞,DC處于啟動、調控、維持免疫應答的中心環(huán)節(jié)。在對抗原的攝取、加工、處理及呈遞過程中,DC具有一般的共性,同時也表達出一些特有的生物學特性。增齡引起的 DC功能下降減弱了機體免疫防御及免疫監(jiān)視作用,致使老年人容易患感染、腫瘤和自身免疫性疾病[1]。國外已有人對普通老年個體單核細胞誘生的 DC(MoDC)細胞表面標志和免疫學功能做了一定研究[2],但對高齡老年個體外周血 MoDC未見有相應的報道。本研究應用流式細胞術,檢測高齡老年人 MoDC細胞亞群和細胞表面標志的變化,探討其在免疫衰老中可能的作用。
1.1 主要試劑及設備 免疫熒光標記的三色人 DC檢測試劑盒(3-color dendritic value bundle)購自美國Becton Dickinson公司,包括 FITC標記的 Lineage Cocktail 1(lin1,由 抗 CD3、 CD14、 CD16、 CD19、CD20、CD56單抗混合組成)、PE標記的抗 CD11c、PE標記的抗 CD123(抗 IL-3Rα)及 PC5標記的抗HLA-DR。流式細胞儀為BECKMAN COULTER公司的CYTOMICSFC500,分析軟件 CXPAnalysis。HLA-DRFITC、CD1a-FITC、 CD40-FITC、 CD80-PE、 CD86-PE、CCR-7-FE、CD209-PE、同亞型對照抗體均購自BD-PharMingen公司;樹突狀細胞培養(yǎng)基 CellGro-DC購自 CellGenix公司;rhGM-CSF、rhIL-4購自上海飛捷公司;淋巴細胞分離液購自 TBD公司;MTT購自上海生工公司;OptiLyse C溶血劑購自 BECKMAN COULTER公司,倒置顯微鏡(Zeiss Axiovert 40)。
1.2 臨床資料 觀察組為高齡老年人 30例(≥80歲 ),平均(85.6 ±4.5)歲,其中男 21例,女 9例 ,排除有腫瘤、糖尿病、慢性感染、自身免疫性疾病、服用免疫抑制劑,并未接受免疫增強劑的治療;普通老年人 30例作為對照組,年齡 60~70歲,平均(64.8±5.1)歲,其中男 18例,女 12例,條件同觀察組。
1.3 DC亞群測定
1.3.1 免疫熒光標記 嚴格按照說明書操作規(guī)程,每個樣本檢測分別取 2管,各加 100μl全血,一管中加入 lin1-FITC、CD123-PE、HLA-DR-PC5,另一管中加入 lin 1-FITC、CD11c-PE、HLA-DR-PC5,閉光 ,室溫孵育 15 min,然后每管加入 OptiLyse C溶血劑1m l,放置 5min,用含 1%的牛血清蛋白和 0.1%疊氮鈉的 PBS洗滌 2遍重新懸浮,進行流式細胞學檢測。
1.3.2 流式細胞儀檢測和分析 通過前向散射角(FSC)和側向散射角(SSC)設門去除死細胞和細胞碎片排除干擾,每個標本計數 50000個細胞,用CXP軟件獲取及分析 HLA-DR/lin1點圖中的 HLADR陽性、lin 1弱陽性和陰性的細胞群體,以 CD11c和 CD123熒光抗體染色陽性細胞百分率記錄結果。
1.4 DC體外培養(yǎng) 新鮮采集的高齡老年人和普通老年人抗凝外周全各 20m l,經淋巴細胞分離液梯度離心(20℃,400×g,20 min),取界面細胞。置入50ml離心管中,用無鈣鎂 PBS(pH7.2)懸浮細胞,離心(650×g,10min)洗細胞 1次,離心(200×g,10 min)洗細胞 2次,洗盡血小板,用 CellGro-DC培養(yǎng)基懸浮細胞,加入 24孔板,每孔 2.5×106細胞 /ml培養(yǎng)基,37℃ 5%CO2孵箱培養(yǎng) 2h后,吸棄上清,用預熱的培養(yǎng)基輕輕洗培養(yǎng)板去除非貼壁細胞,即獲得貼壁的單核細胞,每孔加 1ml CellGro-DC培養(yǎng)基,rhGM-CSF 100 ng/ml,rhIL-4 500 U/ml,于培養(yǎng)第 7天收集懸浮細胞,即為 DC。
1.5 DC表面標志測定 收集培養(yǎng)第 7天的懸浮細胞,用 PBS懸浮為 1×106細胞 /ml,100μl/管加入流式標記管,分別加入各標記抗體及對照抗體,終濃度5μg/ml,置暗處,4℃標記 30 min,加入 4 ml PBS,200×g離心 10min,去掉上清液,如此洗滌共 2次。流式細胞儀檢測細胞表面 CD1a、人類白細胞抗原(human leukocyte antigens,HLA)-DR、CD80、CD86、CD40、趨化因子受體-7(chemokine receptor-7,CCR-7)和 CD209,設立 FSC/SSC,FL1/FL2分析窗口,在FSC/SSC將主細胞群體設門,在 FL1/FL2窗口分析陽性細胞比例,用直方圖顯示。
1.6 統(tǒng)計學分析 采用 SPSS10.0軟件進行數據處理,計量資料用均數 ±標準差(s)表示,2組均數比較用秩和檢驗,以 P≤0.05表示有統(tǒng)計學差異。
2.1 DC亞群 外周血經抗體標記后,流式細胞儀分析 HLA-DR/lin1點圖中的 HLA-DR陽性、lin 1弱陽性和陰性的細胞群體(B門),CD11c熒光抗體染色陽性細胞為 DC1細胞的百分率,CD123熒光抗體染色陽性細胞為 DC2細胞的百分率(圖1)。
實驗結果顯示高齡老年人組 DC1占白細胞總數的百分比較普通老年人組明顯低(P<0.05),DC1與 DC2的比值與后組也有明顯差異(P<0.05)(表1),而 DC2占白細胞總數的百分比較普通老年人組無明顯變化(P>0.05)。
圖1 流式細胞術檢測 DC 1和 DC 2Figure 1 Detection of DC 1 and DC 2by flow cytometry
2.2 DC表面免疫表型分析 收集培養(yǎng)第 7天的懸浮細胞,流式細胞儀檢測表明,高齡老年人組外周血培養(yǎng)獲得的細胞表達 DC標志 CD1a的細胞陽性率低,為 5%~38%,而普通老年人組 CD1a細胞陽性率為 33%~92%。高齡老年人組 DC表達 CD40、CD80、CD86、CD209分子的水平均低于普通老年人組,而 2組間 HLA-DR、CCR-7表達無明顯差異(表2,圖2)。
表1 2組老年人DC亞群均值及比值的比較(s)Table 1 Com parison of the m ean value and ratios of DCs between the aged and elderly groups(s)
表1 2組老年人DC亞群均值及比值的比較(s)Table 1 Com parison of the m ean value and ratios of DCs between the aged and elderly groups(s)
與普通老年人組相比較,*P<0.05
組 別 n DC1/CD11c DC2/CD 123 DC1/DC2高齡老年人組 30 0.207±0.061*0.172±0.045 1.523±0.386*普通老年人組 30 0.298±0.051 0.149±0.031 2.859±0.895
圖2 體外培養(yǎng)第 7天時生成DC的免疫表型Figure 2 Imm unophenotypes of DCs at the 7th day of in vitro cu lture
表2 2組 DC表面標志物陽性細胞的表達(%)Table 2 Exp ressions of DC surfacem arkers in the aged and elderly between tw o groups(%)
免疫衰老是目前老年醫(yī)學研究的熱點之一,有研究表明 T細胞和 B細胞絕對數隨著機體老化呈下降趨勢,其表現(xiàn)是多樣的,DC在攝取抗原或受到某些刺激因子刺激后,可以分化成熟,成熟的 DC迅速失去吞噬活性,并增加主要組織相容性復合物(major histocompatibility complex,MHC)分子與肽復合物的表達和穩(wěn)定性,上調輔助刺激因子和黏附分子的表達,分泌趨化因子等細胞因子,DC的這一功能有效地將抗原遞呈給初始 T細胞并使之激活。而機體衰老過程中 DC的分化和功能的改變已起了人們的關注,然而有關此方面的研究卻少有報道[3-4]。
DC不管在其來源、表型還是在功能上都是異質性群體,機體內存在不同的 DC亞群,主要分為 2個DC亞群:DC1亞群為髓樣細胞來源(myeloid DC),它以 CD11c+DC前體形式存在于外周血中,在炎癥刺激時分化為成熟的 CD11c+DC,產生 IL-12,促進Th0細胞分化為 Th1細胞,介導細胞免疫;DC2亞群為淋巴樣細胞來源(lymphoid DC),由其 CD123+DC前體細胞加 IL-3誘導后分化為成熟的淋巴樣DC,誘導 Th2應答,介導體液免疫[5-6]。本研究結果顯示高齡老年人組 DC1占白細胞總數的百分比較普通老年人組明顯低(P<0.05),DC2占白細胞總數的百分比較普通老年人組無明顯變化(P>0.05),DC1與 DC2的比值也較后組明顯低(P<0.05),高齡老年人的細胞免疫功能明顯下降的,TH1和 TH2細胞功能平衡失調,這與高齡老年人許多免疫相關性疾病的發(fā)生直接相關。
DC表面標志 CD1a、HLA-DR、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、CD40、CCR-7和 CD209參與了免疫反應的正向調節(jié)。CD1a是鑒定DC的最好標志,DC可以應用CD1a來提呈脂類抗原。 CD80、CD86、CD40是 DC表面的協(xié)同刺激分子,它們能使 DC有效攝取及加工提呈抗原,同時提供 T細胞活化所需的共刺激信號,從而啟動T細胞應答[7],CD40可促進 B細胞的分化、發(fā)育、增殖和成熟,促進 T細胞的定向分化。HLA-DR為MHC-Ⅱ類分子,是成熟 DC抗原表面高表達的一類重要分子,主要參與識別和遞呈外源性抗原。DC成熟過程中其細胞膜上 CCR7表達上調,在趨化 DC從外周組織遷移到次級淋巴器官中起關鍵作用[8],并可調控 DC的細胞結構、遷移速度和成熟等。成熟和未成熟的 DC均高表達模式識別受體 CD209(DC-SIGN),識別并幫助 DC捕獲吞噬抗原。高齡老年人組外周血培養(yǎng)獲得的細胞表達 DC標志 CD1a的細胞陽性率明顯較普通老年人組低。高齡老年人組 DC表達 CD40、CD80、CD86、CD209分子的水平均低于普通老年人組,而 2組間 HLA-DR、CCR-7表達無明顯差異。從本研究結果看,高齡老年人 DC的亞群和表面標志較普通老年人出現(xiàn)了一定程度的減退,這似乎可以解釋臨床高齡老人較普通老人更易患感染性疾病和腫瘤,并且DC的上述改變也可能與其他多種老年性疾病的發(fā)生有關。
當今世界人口老齡化是一個發(fā)展趨勢,并且高齡老年人群在老年人群中所占的比例越來越大,高齡老年人的免疫功能低下致使感染性疾病的發(fā)病率明顯增加,已嚴重影響了他們的生命質量,如何減少感染性疾病的發(fā)生率,提高他們的生活質量成為當今老年病學的一個重要的研究課題。本研究結果為進一步探究高齡老年免疫衰老的發(fā)病機制及有效干預提供了一個可靠的實驗理論依據。
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