徐 偉,朱曉娟,蔡 楠,張秀華,范志寧,劉 政,季國忠

0 引 言

大腸癌是指起源于大腸黏膜上皮的惡性腫瘤。近幾年發(fā)病率迅速上升,已成為我國最常見的 5大惡性腫瘤之一,5年生存率 60%左右,但治療效果 30年來無顯著提高[1-2]。李宏武等[3]應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測到在大腸癌組織中肝細(xì)胞生長因子(hepatic growth factor,HGF)及其受體 c-Met mRNA是過量表達(dá)的,且與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究選擇了全人源抗 c-Met單鏈片段及PE38KDEL表達(dá)融合IT,通過選擇大腸癌細(xì)胞株Colo205及 SW480,觀察重組 IT抗 c-Met/PE38KDEL對大腸癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響,為大腸癌的靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 大腸癌細(xì)胞株 Colo205及 SW480均為本實(shí)驗(yàn)室保存。重組 IT抗 c-Met/PE38KDEL為本課題組前期實(shí)驗(yàn)構(gòu)建、表達(dá)并鑒定,能夠特異性的結(jié)合并殺死 c-Met陽性腫瘤細(xì)胞株,而對 c-Met陰性細(xì)胞無結(jié)合活性[4](抗 c-Met單鏈片段是全人源噬菌體 Fab抗體庫篩選出的抗 c-Met的特異性 Fab片段改造得到的,經(jīng)檢測顯示抗c-Met保留有完整抗體分子結(jié)合抗原的特異性,且其免疫原性弱,是腫瘤導(dǎo)向治療的理想載體[4]),DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基購自 Inventrogen公司,胎牛血清購自杭州四季青試劑公司,CCK-8購自Sigma公司,[3H]-亮氨酸購自中國同位素有限公司,caspase檢測試劑盒購自 Biovision公司,不含亮氨酸的 DMEM培養(yǎng)基購自北京清大天一生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 大腸癌細(xì)胞株 Colo205及 SW480均在 37oC、5%CO2條件下,用含 10%胎牛血清(加青霉素 100U/m l、鏈霉素 100μg/m1)的 DMEM培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 CCK-8法檢測 IT抗 c-Met/PE38KDEL對 2株大腸癌細(xì)胞的增殖抑制作用 取對數(shù)生長期Colo205及 SW480細(xì)胞 0.25%胰酶消化制成細(xì)胞懸液,細(xì)胞濃度 1×105/ml接種于 96孔板中,每孔90μl,空白孔加入 90μl DMEM,37℃ 、5%CO2培養(yǎng)葙培養(yǎng) 24h后每孔加藥 10μl,使 IT終濃度分別為0.01、0.1、1、10、100 ng/ml,對照組加入等體積 PBS液,每個濃度 3個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng) 24、48h后,每孔加入 CCK-8 10μl繼續(xù)培養(yǎng) 4h,酶標(biāo)儀 450nm波長下測定各孔吸光度 A值,按下列公式計(jì)算抑制率,以上實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次[5]。

1.4 蛋白合成抑制實(shí)驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)通過[3H]-亮氨酸摻入法檢測重組 IT抗 c-Met/PE38KDEL對大腸癌細(xì)胞株 Colo205及 SW 480的蛋白合成抑制作用。取對數(shù)生長期的Colo205及 SW 480細(xì)胞0.25%的胰酶消化懸浮于含 10%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)液中,細(xì)胞密度 1×105/m l接種至 48孔板中,每孔加入200μl,37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)至細(xì)胞處于對數(shù)生長期后,更換細(xì)胞培養(yǎng)液,加入終濃度分別為0.01、0.1、1、10、100ng/m l的 IT,對照組加入等體積的 PBS液。繼續(xù)培養(yǎng) 5、24h后,分別用預(yù)冷 PBS液及 0.1%胎牛血清洗滌 2遍后,在不含亮氨酸的DMEM培養(yǎng)基中加入[3H]-亮氨酸(終濃度為 2 μCi/m l),繼續(xù) 37℃培養(yǎng) 45min,終止培養(yǎng),把培養(yǎng)板放在冰蓋上,每孔用 1ml 5%三氯醋酸洗滌 2遍(10min、5 min)后 ,每孔加入 0.5ml 0.1mol/L KOH,室溫放置 10～15min?；靹?移入閃爍瓶中,測定每分鐘脈沖數(shù)(次 /min),每孔 3個復(fù)孔,至少測 3遍。以實(shí)驗(yàn)組 cmp/對照組 cmp百分比來表示亮氨酸摻入率[6]。LOGTT法計(jì)算半數(shù)抑制濃度。本實(shí)驗(yàn)在南京醫(yī)科大學(xué)同位素實(shí)驗(yàn)室完成。

1.5 Caspase活性測定 實(shí)驗(yàn)分 IT組及空白對照組。取對數(shù)生長期Colo205及 SW 480細(xì)胞 0.25%胰酶消化制成細(xì)胞懸液,接種至 150ml無菌細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期(細(xì)胞濃度為 106/ml),分別加入 IT至終濃度為 100 ng/ml,作用 24h后收集細(xì)胞,室溫 1000 r/m in離心5min,離心半徑 6 cm,棄上清,加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解緩沖液 50μl,冰上孵育 10min,10 000×g,4℃離心1 min,回收上清于 EP管中,置于冰上。每管依次加入 50μl的 2×反應(yīng)緩沖液(使用前 1m l的 2×反應(yīng)緩沖液加 1.0mol/L DTT 10μl),再加入 4mm/L的底物 5 μl(終濃度為 200μmol/L)(DEVD-ρNA,caspase3;IETD-ρNA,caspase-8),37℃孵育 1～ 2 h。轉(zhuǎn)移至 96孔板中,以分光光度計(jì) 405nm處測定底物裂解產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度(均按試劑盒說明進(jìn)行,以上實(shí)驗(yàn)相同條件下重復(fù) 3次)。

2 結(jié) 果

2.1 重組 IT抗 c-Met/PE38KDEL對大腸癌細(xì)胞株增殖抑制作用的影響 IT對 2株大腸癌細(xì)胞的增殖抑制作用都呈時間、劑量依賴關(guān)系(見圖1),并隨著 IT濃度的升高抑制作用逐漸增強(qiáng)。48 h 100ng/m l時對 Colo205及 SW480的增殖抑制作用最強(qiáng),抑制率分別為 80.62%及 77.83%,與陰性對照組相比具有顯著性差異(P＜0.01)。

2.2 重組 IT抗 c-Met/PE38KDEL對大腸癌細(xì)胞株蛋白合成抑制的影響 IT對 2株大腸癌細(xì)胞株蛋白合成抑制作用見圖2,可以看到,IT對細(xì)胞株的蛋白合成抑制呈時間、劑量依賴性。24h IT對Colo205及 SW480的 IC50分別為 6.14 ng/ml與 7.26ng/ml。在 IT(100 ng/ml)作用 24h后 ,對 Colo205及 SW480的的蛋白抑制率分別接近 90%及 85%。

圖1 重組IT抗 c-Met/PE 38KDEL對Colo205及 SW 480大腸癌細(xì)胞株增殖抑制作用的影響Figure 1 Inhibitory effect of IT anti-c-Met/PE38KDEL on the proliferation of human colorectal cancer cells

圖2 重組IT抗c-Met/PE 38KDEL對大腸癌細(xì)胞株蛋白合成抑制的影響Figure 2 Inhibitory effect of IT anti-c-Met/PE38KDEL on the protein synthesis in human colorectal cancer cells

2.3 Caspase-3及 caspase-8活性檢測 IT作用于 2株大腸癌細(xì)胞 24h后 caspase-3及 caspase8活性的變化見表1。2株細(xì)胞 IT組 caspase-3升高顯著高于陰性對照組,與對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。2株細(xì)胞 caspase-8蛋白也有輕度升高,提示抗 c-Met/PE38KDEL在誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞凋亡的過程中 caspases蛋白酶家族可能起了重要的作用。

表1 IT抗 c-Met/PE 38KDEL對 2株大腸癌細(xì)胞 caspase-3、8的影響(s)Table 1 Effect of IT anti-c-Met/PE 38KDEL on human colorectal cancer cell lines caspase-3and-8(s)

與對照組比較:*P＜0.05,**P＜0.01

細(xì)胞 Caspase-3(n=3)Caspase-8(n=3)對照組 IT組 對照組 IT組Colo205 0.101±0.047 0.370±0.093** 0.128±0.019 0.274±0.066*SW480 0.113±0.031 0.346±0.051** 0.119±0.054 0.218±0.089

3 討 論

目前靶向治療逐漸受到關(guān)注,IT有希望使腫瘤治療從姑息性治療轉(zhuǎn)為根治[7]。IT是由特異性的單克隆抗體或生長因子與具有殺傷作用的毒素分子通過化學(xué)交聯(lián)構(gòu)建而成。與其他抗腫瘤藥物相比,IT具有毒性強(qiáng)和特異性高的優(yōu)點(diǎn),在腫瘤治療中顯示出巨大的應(yīng)用前景。c-Met是一種由 c-MET原癌基因編碼的蛋白產(chǎn)物,與多種癌基因產(chǎn)物和調(diào)節(jié)蛋白相關(guān),參與細(xì)胞信息傳導(dǎo)、細(xì)胞骨架重排的調(diào)控,是細(xì)胞增殖、分化和運(yùn)動的重要因素,抑制 c-Met的表達(dá)可抑制癌細(xì)胞的增殖、運(yùn)動、侵襲和轉(zhuǎn)移[8-9]。因此 c-Met也成為抗腫瘤治療的重要靶點(diǎn)[10]。本實(shí)驗(yàn)觀察抗c-Met/PE38KDEL對大腸癌細(xì)胞的增殖抑制作用,為大腸癌導(dǎo)向治療奠定基礎(chǔ)。

本研究表明,在 IT抗 c-Met/PE38KDEL作用于2株大腸癌細(xì)胞后,蛋白合成有明顯的降低,24h后抗 c-Met/PE38KDEL在濃度為 100ng/ml時對 2株細(xì)胞的蛋白抑制率就達(dá)到了85%～90%,表明IT抗c-Met/PE38KDEL可能是通過抑制癌細(xì)胞蛋白合成來發(fā)揮抗癌作用的。

在凋亡程序的啟動及執(zhí)行過程中,caspases蛋白酶家族起了非常重要的作用。Caspase-3是caspase級聯(lián)反應(yīng)中最關(guān)鍵的效應(yīng)蛋白酶,通常以酶原的形式存在,激活后通過酶解其特異性底物,使細(xì)胞發(fā)生凋亡。本實(shí)驗(yàn)分析 caspase-3、caspase-8活性在抗 c-Met/PE38KDEL干預(yù)前后的變化發(fā)現(xiàn),caspase-3、caspase-8活性較對照組都有升高,提示Caspases蛋白酶家族在抗 c-Met/PE38KDEL誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞凋亡的過程起了較為重要的作用。

可以看到,重組 IT抗 c-Met/PE38KDEL對大腸癌細(xì)胞株有顯著的增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡的作用,因此本研究為大腸癌的靶向治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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