陸邦超,鄒大進(jìn)

0 引 言

急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是臨床常見(jiàn)的急腹癥之一,目前尚無(wú)特異性的防治措施[1-2]。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn) PPARγ及其激動(dòng)劑對(duì) AP損傷,尤其是在 ANP中具有保護(hù)作用[3-4],其機(jī)制可能涉及 NFкβ/TNFα這條炎癥通路[5-7],但具體作用機(jī)制仍不完全清楚。P38MAPK是調(diào)控機(jī)體炎癥反應(yīng)的中心環(huán)節(jié),與 ANP的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。PPARγ及其激動(dòng)劑在 ANP中的抗炎機(jī)制與p38MAPK炎性通路的關(guān)系如何?國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)觀察了 PPARγ激動(dòng)劑吡咯列酮對(duì)ANP大鼠 P38MAPK活性和下游炎癥因子的影響,以期望從細(xì)胞分子水平探討其抑制 ANP的具體作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物與主要試劑 結(jié)晶牛磺膽酸鈉、磷酸化p38MAPK一抗購(gòu)自 Sigma公司;吡咯列酮購(gòu)自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司(國(guó)藥準(zhǔn)字 H 20040631);TNF-α、IL-1β細(xì)胞因子 ELISA試劑盒購(gòu)自南京麥科特生物公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康清潔級(jí)雄性Wistar 3月齡大鼠 54只(由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供),體重 300～330g,在 12 h明暗交替光照下飼養(yǎng),可隨意進(jìn)食、進(jìn)水。合格證號(hào):0008392。按數(shù)字表法隨機(jī)分為 3組:假手術(shù)組、ANP組、吡咯列酮組。

1.2.2 動(dòng)物模型建立及用藥 大鼠實(shí)驗(yàn)前禁食 12 h,不禁水。5%鹽酸氯胺酮 100mg/kg體重腹腔注射麻醉后,消毒腹部皮膚,上腹正中切口入腹腔。ANP組沿十二指腸內(nèi)側(cè)找到胰膽管開(kāi)口,用 4號(hào)頭皮靜脈針在近十二指腸開(kāi)口端逆行刺入胰膽管,用2枚無(wú)損傷血管夾分別夾住肝門部膽管和穿刺針,向胰管內(nèi)勻速(0.1 ml/min)注射 4%?；悄懰徕c 1 m l/kg體重,注射完畢留針 5 min,連續(xù)縫合關(guān)閉腹腔。假手術(shù)組開(kāi)腹后注射等量等滲鹽水。吡格列酮組在術(shù)前 2 h腹腔內(nèi)注射 0.2%DMSO-吡格列酮 20 mg/kg體重,制模方法同 ANP組。各組術(shù)后 3、6、12 h分批按數(shù)字表法處死大鼠,取血和胰腺組織。

1.2.3 大鼠血清淀粉酶測(cè)定 采用酶法在全自動(dòng)生化分析儀上測(cè)定。

1.2.4 大鼠胰腺組織病理學(xué)觀察 胰腺組織常規(guī)中性福爾馬林固定,石蠟包埋,切成 4μm的切片,HE染色,光學(xué)顯微鏡下,由病理科醫(yī)師觀察胰腺病理變化。

1.2.5 大鼠血清 TNF-α、IL-1β的測(cè)定 采用酶聯(lián)免疫吸附法,按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.6 Western blot檢測(cè)大鼠胰腺組織p-p38 MAPK蛋白的表達(dá) 取液氮中貯存的胰腺組織 100mg剪碎后于液氮中研磨,然后按照操作說(shuō)明用細(xì)胞裂解液抽提胞漿蛋白,以 Bardford法測(cè)定胞漿總蛋白;按40μg蛋白樣本 /孔進(jìn)行 SDS-PAGE電泳,結(jié)束后電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜;以 50g/L脫脂奶粉的 1xTBST溶液室溫封閉 PVDF膜;兔抗大鼠磷酸化 p38MAPK一抗溫育,洗膜;山羊抗兔 IgG-HRP二抗溫育,洗膜,加ECL發(fā)光劑對(duì)膠片爆光;使用凝膠成像分析系統(tǒng)對(duì)目的條帶進(jìn)行掃描和密度分析,以相應(yīng)蛋白條帶的平均光密度值來(lái)表示 p38MAPK磷酸化活化水平的相對(duì)強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用 SPSS12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù),計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示,多組均數(shù)比較采用單因素方差分析,兩兩比較用 LSD法,以 P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 血清淀粉酶、TNF-α、IL-1β的變化 ANP組大鼠血清淀粉酶、TNF-α和 IL-1β水平隨著病程進(jìn)展而升高(P＜0.01),在相同時(shí)間點(diǎn) ANP組水平顯著高于假手術(shù)組(P＜0.01)。吡咯列酮組各時(shí)間點(diǎn)血清淀粉酶、TNF-α和 IL-1β較 ANP組下降(P＜0.05),但仍顯著高于假手術(shù)組(P＜0.01)。見(jiàn)表1。

2.2 胰腺組織病理學(xué)觀察 假手術(shù)組胰腺小葉完整,胰腺細(xì)胞形態(tài)正常,胰島清晰可見(jiàn),間質(zhì)無(wú)充血水腫,無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。ANP組 3h胰腺小葉結(jié)構(gòu)尚完整,胰腺腺泡細(xì)胞水腫,小葉間隙略有增寬,間質(zhì)及腺泡內(nèi)有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn),可見(jiàn)灶性凝固性壞死,無(wú)明顯出血。隨著時(shí)間的延長(zhǎng),ANP組病變加重。ANP組 6h胰腺腺小葉結(jié)構(gòu)紊亂,腺泡細(xì)胞水腫,間質(zhì)增寬,中等量炎細(xì)胞浸潤(rùn),腺泡間隙可見(jiàn)出血現(xiàn)象。ANP組 12h見(jiàn)胰腺腺泡結(jié)構(gòu)破壞,有大片無(wú)結(jié)構(gòu)壞死區(qū),中等量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。吡咯列酮組各時(shí)相點(diǎn)病理改變較 ANP組明顯減輕。見(jiàn)圖1。

2.3 胰腺組織 p-p38MAPK蛋白的表達(dá) p-p38MAPK蛋白在假手術(shù)組胰腺組織有微量的表達(dá)。ANP組胰腺 p-p38MAPK表達(dá)迅速上升,3h達(dá)高峰(3.97±0.94,P＜0.01),隨后逐漸下降,12h仍高于假手術(shù)組(1.45±0.17,P＜0.05)。吡咯列酮組胰腺組織p-p38MAPK與 ANP組有相似的表達(dá)規(guī)律,但各時(shí)間點(diǎn)較 ANP組明顯降低(2.31±0.63,1.63±0.27,1.28±0.07,P＜0.05)。見(jiàn)圖2。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清淀粉酶、TNF-α和IL-1β水平的比較(s)Table 1 Levels of serum amylase,TNF-αand IL-1β at different time points in different groups(s)

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清淀粉酶、TNF-α和IL-1β水平的比較(s)Table 1 Levels of serum amylase,TNF-αand IL-1β at different time points in different groups(s)

與假手術(shù)組相比:*P＜0.01;與 ANP組相比,△P＜0.05,△△P＜0.01;與同組 3h相比,#P＜0.01

檢測(cè)指標(biāo) 分組 n 3h 6h 12h淀粉酶 假手術(shù)組 6 1075.38±133.55 1238.43±153.24 1308.63±165.79 ANP組 6 3546.03±278.57* 4747.80±499.13*# 7029.42±282.06*#吡咯列酮組 6 3044.65±360.19*△ 4105.08±371.68*△ 3515.32±380.35*△TNF-α 假手術(shù)組 6 41.25±5.58 43.70±6.26 45.55±7.17 ANP組 6 154.41±30.68* 293.71±25.42*# 361.15±28.22*#吡咯列酮組 6 105.62±25.03*△ 128.03±19.37*△△ 268.44±24.34*△△IL-1β 假手術(shù)組 6 28.08±4.94 29.82±7.98 34.05±7.87 ANP組 6 237.24±35.54* 300.46±36.44*# 321.09±32.18*#吡咯列酮組 6 190.71±26.52*△ 251.07±30.19*△ 209.42±27.10*△△

圖1 各組大鼠胰腺組織病理切片(HE×200)Figure 1 Pathological sections of the pancreatic tissue in different groups(HE×200)

圖2 各組大鼠胰腺組織p-p 38MAPK蛋白的表達(dá)Figure 2 Exp ressions of p-p 38MAPK in the pancreatic tissue of different groups

3 討 論

MAPKs是多種細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的重要樞紐,其中P38MAPK通路在機(jī)體應(yīng)激和炎癥反應(yīng)調(diào)控過(guò)程中具有極其重要作用。應(yīng)激和各種刺激因素如細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)、體液滲透壓改變、氧自由基、紫外線等均可激活 P38MAPK上游激酶 MKK3、MKK4、MKK6等,活化胞質(zhì)中的 P38MAPK;P38MAPK激活后遷移入胞核內(nèi),可促進(jìn) IL-1、IL-6、TNF-α等多種促炎因子的表達(dá)和釋放。近年來(lái),發(fā)現(xiàn) P38MAPK通路與 ANP的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。任洪波等[8]采用?；悄懰徕c逆行胰膽管注射法建立 ANP大鼠模型,發(fā)現(xiàn)胰腺P38MAPK的活性于術(shù)后 3h達(dá)到高峰,至 12 h仍顯著高于基礎(chǔ)值,其在肺組織的活性也隨之升高,研究者認(rèn)為 P38MAPK的激活在 ANP時(shí)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng),貫穿于整個(gè)發(fā)病的早期階段,不但與胰腺本身的病程進(jìn)展有關(guān),而且參與急性肺損傷的發(fā)生;應(yīng)用P38MAPK阻滯劑(CN11493)能抑制炎性因子 IL-1、TNF-α的釋放,明顯改善胰腺及肺組織的病理?yè)p傷。Pereda等[9]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示特異性阻斷 P38MAPK的激活,可降低 ANP大鼠肺髓過(guò)氧化物酶的活性,抑制腹水生成,并提高術(shù)后生存率。Samuel等[10]和Chen等[11]實(shí)驗(yàn)均得出相同結(jié)論。Blinman等[12]通過(guò)對(duì)離體胰腺腺泡細(xì)胞的研究,發(fā)現(xiàn)胰腺炎時(shí)P38MAPK活性明顯升高,并產(chǎn)生 IL-1、TNF-α等多種細(xì)胞因子及趨化因子,應(yīng)用 P38MAPK抑制劑(SB203580)能抑制上述因子合成;而 NFкβ抑制劑的抗炎作用則相對(duì)較弱,認(rèn)為在 AP時(shí) P38MAPK和NFкβ是調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和趨化因子產(chǎn)生的 2條主要信號(hào)途徑,其中 P38MAPK較 NFкβ更占主導(dǎo)地位。Liu等[13]研究進(jìn)一步證實(shí),P38MAPK是 NFкβ的上游激酶,ANP中還參與了 NFкβ的活化。所以 ANP發(fā)病機(jī)制中,P38MAPK是較 NFкβ更重要的一條炎癥反應(yīng)信號(hào)通路。

本實(shí)驗(yàn)予 4%牛磺膽酸鈉逆行膽胰管注射建立ANP大鼠模型。吡咯列酮預(yù)處理后,可以降低血清IL-1β、TNF-α及淀粉酶的水平,減輕大鼠胰腺的病理?yè)p傷,表明吡咯列酮具有一定的預(yù)防 ANP的療效。這與 Konturek等[14]、李清華等[15]結(jié)果一致。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)胰腺 P38MAPK的活性于術(shù)后 3h達(dá)到高峰,之后逐漸下降,至 12 h仍高于基礎(chǔ)值,提示P38MAPK在 ANP早期被活化,與 ANP的病理機(jī)制有關(guān)。而吡咯列酮明顯減少胰腺組織 P38MAPK的表達(dá),表明吡咯列酮可能通過(guò)抑制 P38MAPK的活性,減少炎性介質(zhì)的產(chǎn)生,從而減輕全身炎癥反應(yīng),發(fā)揮對(duì)胰腺的保護(hù)作用。但其具體作用機(jī)制仍不清楚,因此對(duì)于吡咯列酮與 P38MAPK、TNF-α等炎性因子在 ANP中的相互作用及作用環(huán)節(jié)值得進(jìn)一步研究。

[1]季大璽,黎磊石.重癥急性胰腺炎的連續(xù)性血液凈化治療[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào),2010,23(4):337-341.

[2]李敏麗,朱人敏.重癥急性胰腺炎肝損傷機(jī)制的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào),2009,22(10):1102-1106.

[3]Rollins MD,Sudarshan S,Firpo MA,et al.Anti-inflammatory effects of PPAR-gamma agonistsdirectly correlate with PPAR-gamma expression during acute pancreatitis[J].J Gastrointest Surg,2006,10(8):1120-1130.

[4]徐克群,沈云志,薛樂(lè)寧,等.過(guò)氧化物酶增殖物激活受體激動(dòng)劑(羅格列酮)在大鼠急性壞死性胰腺炎中的防治作用[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2009,12(2):172-176.

[5]聶盛丹,呂 品,苗雄鷹,等.過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體激動(dòng)劑治療急性胰腺炎的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2007,17(5):539-542.

[6]Xu P,Zhou XJ,Chen LQ,et al.Pioglitazone attenuates the severity of sodium taurocholate-induced severe acute pancreatitis[J].World J Gastroenterol,2007,13(13):1983-1988.

[7]Cuzzocrea S,Pisano B,Dugo L,et al.Rosiglitazone,a ligand of the peroxisome proliferator-activated receptor-gamma,reduces acute pancreatitis induced by cerulein[J].Intensive Care Med,2004,30(5):951-956.

[8]任洪波,李延青.程寶泉,等.絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑對(duì)重癥急性胰腺炎治療作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華消化雜志,2006,26(5):343-345.

[9]Pereda J,Sabater L,Cassinello N,et al.Effect of simultaneous inhibition of TNF-alpha production and xanthine oxidase in experimental acute pancreatitis:the role of mitogen activated protein kinases[J].Ann Surg,2004,240(1):108-116.

[10]Samuel I,Zaheer A,Fisher RA.In vitro evidence for role of ERK,P38,and JNK in exocrine pancreatic cytokine production[J].JGastrointest Surg,2006,10(10):1376-1383.

[11]Chen P,Zhang Y,Qiao M,et al.Actiated protein C,an anticoagulant polypeptide,ameliorates severe acute pancreatitis via regulation of mitogen-activated protein kinases[J].J Gastroenterol,2007,42(11):887-896.

[12]Blinman TA,llya G,Michelle M,et al.Activation of pancreatic acinar cells on isolation from tissue cytokine up regulation via p38 MAP kinase[J].Am JPhysiol Cell Physiol,2000,279(6):1993-1997.

[13]Liu HS,Pan CE,Liu QG,et al.Effect of NF-kappaB and p38MAPK in activated monocytes/macrophages on pro-inflammatory cytokines of rats with acute pancreatitis[J].World J Gastroenterol,2003,9(11):2513-2518.

[14]Konturek PC,Dembinski A,Warzecha Z,et al.Pioglitazone,a specific ligand of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma,protects pancreas against acute cerulein-induced pancreatitis[J].World J Gastroenterol,2005,11(40):6322-6329.

[15]李清華,徐 萍,陳令全,等.吡格列酮預(yù)處理對(duì)急性壞死性胰腺炎大鼠模型的影響[J].中華胰腺病學(xué),2008,8(3):173-175.