周海云，歐陽群香，彭敏芝，李 維

(中山大學測試中心，廣東 廣州 510275)

氯化消毒是一種常見的殺菌消毒方式，不少研究發(fā)現(xiàn)有機化合物與有效氯反應后能生成一些對人類健康構(gòu)成潛在隱患的化合物。喹諾酮類藥是一類廣譜、使用量大的抗生素類藥物，喹諾酮環(huán)是這類藥物的主要活性基團。為加強抗生素的藥效，通常在喹諾酮環(huán)上附加F、對二氮己環(huán)，衍變成環(huán)丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星等藥品。近年來，地表水或飲用水源中檢出喹諾酮類藥物的報道引起廣泛的關注[1-7]。

抗生素在氯化消毒過程中能夠衍生出一系列的化合物[8-12]。朱舟等[8]利用SOS/umu遺傳毒性測試方法對諾氟沙星在不同氯化反應時間得到的反應溶液進行毒性測試，實驗結(jié)果表明反應過程中生成了遺傳毒性高于母體的中間產(chǎn)物。Dodd等[9]研究了環(huán)丙沙星和恩諾沙星的氯化反應動力學，通過LC/MS得到的質(zhì)譜信息推測化合物的結(jié)構(gòu)、反應途徑及反應產(chǎn)物的抑菌活性。產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)直接影響其遺傳毒性，因此很有必要對喹諾酮類藥物在氯化消毒過程中可能產(chǎn)生的產(chǎn)物進行結(jié)構(gòu)分析。本文選取喹諾酮類藥物中使用量較大的廣譜抗生素環(huán)丙沙星作為研究對象，對該物質(zhì)在氯化反應過程中產(chǎn)生的物質(zhì)進行分離和結(jié)構(gòu)鑒定，根據(jù)所生成的產(chǎn)物推斷反應途徑。本文的試驗結(jié)果能夠為更好地評價該類藥物在氯化消毒過程中造成的潛在問題提供數(shù)據(jù)參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

MAT 95 XP高分辨質(zhì)譜儀(電子轟擊EI電離源) (Thermo, USA); Varian Unity 400 MHz核磁共振波譜儀(Varian，USA)；LC-20A高效液相色譜儀(島津)；固相萃取裝置及Supelclean C18固相萃取小柱 (500 mg/3ml) (Supelco，USA)。

環(huán)丙沙星 (w≥98.0%)購自 Fluka (Buchs，瑞士)；甲醇、乙腈均為色譜純 (Merck)；其它試劑為分析純。試驗用純水為桶裝水。

1.2 氯化反應試驗

環(huán)丙沙星儲備液配制：準確稱取2.5 mg于25 mL棕色容量瓶中，加入0.2 mol/L NaOH溶液溶解，用水定容至刻度，儲備液置于4 ℃冰箱中保存。以磷酸緩沖液稀釋儲備液使環(huán)丙沙星的質(zhì)量濃度為1.0 mg/L，以此為反應溶液。反應在接近自然水體pH=6的條件下進行。

移取1 mL環(huán)丙沙星反應液于一系列的10 mL具塞試管中，分別加入 8 mL pH=6的磷酸緩沖溶液，然后加入一定量的NaClO溶液, 使藥物的摩爾濃度與有效氯摩爾濃度的比值分別為1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10，加緩沖液至刻度。開始反應，每隔一段時間取樣500 μL，以抗壞血酸作為反應終止劑終止反應，樣品進HPLC 分析。

1.3 氯化產(chǎn)物HPLC分析條件

色譜柱：Shim-Pack VP-ODS (150 mm×4.6 mm, 5 μm) 分析柱和shim-pack GVP-ODS (50 mm×4.6 mm, 5 μm) 保護柱；流動相為甲醇和0.5 g/L磷酸溶液(三乙胺調(diào)節(jié)pH值至3.2)，體積比為25∶75，流速0.8 mL/min。采用二極管陣列檢測器進行檢測，檢測波長為278 nm。

1.4 產(chǎn)物富集

將反應液環(huán)丙沙星的濃度放大到100 mg/L進行反應，終止反應后的反應溶液經(jīng)C18固相萃取小柱富集。上樣前，先依次以2 mL甲醇，2 mL水活化固相萃取小柱。樣品流過C18固相萃取小柱后，先用蒸餾水2 mL沖洗出柱中殘留的無機鹽，再用4 mL乙酸酸化甲醇(pH 3～5)洗脫氯化產(chǎn)物。洗脫液先加入無水硫酸鈉干燥去水，過濾。濾液在室溫下讓溶劑自然揮發(fā)，收集析出的固體物質(zhì)，采用質(zhì)譜、NMR等儀器對這些物質(zhì)進行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC法測定環(huán)丙沙星的氯消毒副產(chǎn)物

圖1表示氯化反應進行到35 min 時用抗壞血酸作反應終止劑終止反應后，反應液的HPLC譜圖。譜圖上出現(xiàn)在7.70 min處的色譜峰所對應的物質(zhì)為環(huán)丙沙星，保留時間分別在6.45、9.11、10.57、11.30 min 處所對應的物質(zhì)為氯化反應后生成的產(chǎn)物。

本文同時考察了有效氯濃度對生成產(chǎn)物的影響。當環(huán)丙沙星濃度為0.1 mg/L，調(diào)節(jié)有效氯濃度使反應體系中環(huán)丙沙星與有效氯的摩爾濃度比值分別為1∶2，1∶4，1∶6，1∶8和1∶10。每隔一段時間取樣500 μL，以抗壞血酸作為反應終止劑終止反應，樣品進HPLC 分析，從色譜峰的出峰數(shù)目和保留時間進行定性比較。結(jié)果顯示，在所測試的NaClO溶液濃度范圍內(nèi)(0.6～3.0 mmol/L)，有效氯濃度越高，反應速度越快，但沒有新的產(chǎn)物峰出現(xiàn)；生成的產(chǎn)物在有效氯過量情況下會繼續(xù)反應，致使產(chǎn)物濃度降低。

圖1 pH=6的條件下, 環(huán)丙沙星(CIP)與NaClO反應35 min后反應液的HPLC色譜圖環(huán)丙沙星與有效氯的摩爾濃度比值為1∶6，數(shù)字所示為主要氯化反應產(chǎn)物

2.2 環(huán)丙沙星氯化產(chǎn)物的鑒定

電噴霧(± ESI)質(zhì)譜基本上不出現(xiàn)碎片離子，樣品在+ESI模式通常會出現(xiàn)[M+H]+準分子離子峰的信號，在-ESI模式通常會出現(xiàn)[M-H]-準分子離子峰的信號，從同位素峰的豐度比可以推斷出含鹵素的數(shù)量。因此，直接進樣的方式可以實現(xiàn)對樣品的快速定性。實驗中采用SPE法將反應產(chǎn)物提取至有機相后，分別在+/- ESI模式下進行反應產(chǎn)物混合物的質(zhì)譜分析。+ESI電離模式下，樣品出現(xiàn)m/z356、366、306、322等信號；-ESI電離模式下出現(xiàn)m/z354、364、304、320和296的信號。由此可以初步判斷產(chǎn)物中可能存在相對分子質(zhì)量分別為355、365、305、321和297的產(chǎn)物。

由于生成產(chǎn)物汽化溫度較高，未能在GC/MS上進行混合物的分離分析。為進一步確定化合物的分子量，在電子轟擊電離(EI)模式下，將揮干溶劑后的反應產(chǎn)物混合物以直接進樣方式(進樣桿程序升溫從45 ℃以100 ℃/min的加熱速率加熱到350 ℃，然后維持5 min)進行相對分子質(zhì)量分析，在不同的汽化溫度和掃描時間出現(xiàn)了m/z355，365，305，321和297信息。結(jié)合+/- ESI和EI質(zhì)譜的檢測結(jié)果，最后確定了上述5個化合物的相對分子質(zhì)量信息。

質(zhì)譜信息只能提供化合物的相對分子質(zhì)量、含Cl元素的數(shù)量，對結(jié)構(gòu)信息準確判斷還需要NMR譜數(shù)據(jù)進行確證。因此，為能得到進行NMR試驗必須的樣品量，將試驗放大，中止反應后的樣品液經(jīng)C18固相萃取柱富集分離得到3個較純的固體化合物，然后進行1H NMR分析，進而推斷它們的結(jié)構(gòu)。對沒能分離得到的化合物，結(jié)合高分辨質(zhì)譜儀的精確質(zhì)量數(shù)和元素組成測定結(jié)果、電噴霧質(zhì)譜MSn特征碎片信息，推導出化合物最可能的結(jié)構(gòu)。

化合物A：白色固體。EI 質(zhì)譜圖顯示其相對分子質(zhì)量為365, [M] ∶ [M+2]同位素峰豐度比接近3∶1，表示其含1個Cl。高分辨質(zhì)譜測得其精確質(zhì)量數(shù)為365.092 3(-4.0)，元素組成為C17H17O3N3Cl1F。從化合物的元素組成初步可以推斷，此化合物是在環(huán)丙沙星(C17H18O3N3F)結(jié)構(gòu)上加上一個Cl。

1H NMR 譜存在9組信息(溶劑DMSO)：δ1.16 (2H, m) 和δ1.33 (2H, m)為環(huán)丙基仲碳上的H，δ7.61 (1H, m) 為環(huán)丙基叔碳上H；δ7.96 (1H, d) 為苯環(huán)上5位碳相連的H，由于F存在，引起裂分生成二重峰；δ8.69 (1H, s)為2位碳相連的H，δ15.10 (1H, s)為羧基上的H；δ3.31 (4H, m) 和δ3.49 (4H, m)是對二氮己環(huán)仲碳上的氫，δ9.46 (1H, br)是對二氮己環(huán)仲胺上的氫。根據(jù)質(zhì)譜和NMR信息，推斷此產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)是在環(huán)丙沙星結(jié)構(gòu)不變的基礎上，喹諾酮環(huán)C8位上連Cl, 產(chǎn)物結(jié)構(gòu)如圖2所示A。

化合物A的EI質(zhì)譜圖、主要碎片離子的歸屬如圖2所示。所形成的碎片主要是通過脫氯、脫羧、以及開環(huán)所產(chǎn)生。

圖2 化合物A的EI質(zhì)譜圖及主要碎片離子的歸屬

化合物B：白色固體。EI 質(zhì)譜圖顯示其相對分子質(zhì)量為355，[M] ∶[M+2] ∶[M+4]同位素峰豐度比例接近9∶6∶1，顯示其含2個Cl。高分辨質(zhì)譜測得其精確質(zhì)量數(shù)為355.064 9(-0.3)，元素組成為C16H16ON3Cl2F。從化合物的元素組成初步可以推斷，此化合物是脫羧氯代產(chǎn)物。

1H NMR 譜存在8組信息(溶劑DMSO)：δ0.90 (2H, m) 和δ1.11 (2H, m)為環(huán)丙基仲碳上的H，δ4.17 (1H, m) 為環(huán)丙基叔碳上H；δ7. 84 (1H, d) 為苯環(huán)上5位碳相連的H，由于F存在，引起裂分生成二重峰；δ8.49 (1H, s)為2位碳相連的H，δ3.26 (4H, m) 和δ3.49 (4H, m)是對二氮己環(huán)上仲碳上的氫，δ8.49 (1H, br)是對二氮己環(huán)仲胺上的氫。根據(jù)質(zhì)譜和NMR信息，推斷此產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)如圖3所示B。

化合物B的EI質(zhì)譜圖、主要碎片離子的歸屬如圖3所示。碎片m/z56和m/z57是由對二氮己環(huán)裂解形成的；從碎片離子m/z313和m/z272的同位素峰豐度比值判斷，這兩個離子均含有2個Cl，因此，這兩個離子分別是通過對二氮己環(huán)裂解以及環(huán)丙基的丟失形成的，由此也可以說明Cl是連接在喹諾酮環(huán)上?；衔顱的EI質(zhì)譜中的離子主要是通過脫氯、脫羧、以及開環(huán)所產(chǎn)生。

圖3 化合物B的EI質(zhì)譜圖及主要碎片離子的歸屬

化合物C：白色固體。EI質(zhì)譜圖顯示相對分子質(zhì)量為297(-ESI 為296), [M] ∶ [M+2]同位素峰豐度比值接近3∶1，判斷此化合物含1個Cl。高分辨測得其精確質(zhì)量數(shù)為297.019 7(-0.6)，元素組成為C13H9O4N1ClF。1H NMR 譜存在7組信息(溶劑DMSO)：δ1.07 (2H, m) 和δ1.22 (2H, m)為環(huán)丙基仲碳上的H，δ4.39(1H, m) 為環(huán)丙基叔碳上H；δ7.78 (1H, d) 為苯環(huán)上5位碳相連的H，由于F存在，引起裂分生成二重峰；δ7.78 (1H, s)為2位碳相連的H，δ12.00(1H, br)為7碳相連-OH上的H，δ14.70 (1H, br)為羧基上的H。根據(jù)上述信息可以推斷此化合物結(jié)構(gòu)為圖4所示C?；衔顲的EI質(zhì)譜圖、主要碎片離子的歸屬如圖4所示。此化合物的碎片離子較多，高質(zhì)量端的碎片離子主要是通過喹諾酮環(huán)上官能團丟失例如脫羧、環(huán)丙基丟失等過程形成。

圖4 化合物C的EI質(zhì)譜圖及主要碎片離子的歸屬

化合物D：產(chǎn)物混合物直接進樣得到的+ESI和EI 質(zhì)譜圖中顯示產(chǎn)物當中有一個相對分子質(zhì)量為321的產(chǎn)物，但沒能分離純化得到相關化合物進行NMR分析，質(zhì)譜數(shù)據(jù)顯示此化合物的[M]∶[M+2]同位素峰豐度比例接近3∶1，可以確定此化合物是為一氯產(chǎn)物。在EI模式下，針對質(zhì)量數(shù)321進行精確質(zhì)量數(shù)測定和元素組成計算，精確質(zhì)量數(shù)為321.103 6(-1.0)，元素組成為C16H17ON3ClF。此化合物產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量與反應物環(huán)丙沙星相差10，反應物失去-COOH、加-Cl，兩者的差值剛好為10，根據(jù)可能的反應機理，認為該產(chǎn)物應該是反應物脫羧氯代化合物，結(jié)構(gòu)如圖5所示D。

因沒能分離得到較純的化合物D，其EI質(zhì)譜圖碎片離子的歸屬較難解釋。因此，在+ESI模式下，針對此化合物產(chǎn)生的[M+H]+離子m/z322進行MSn分析，在30%～40%的能量下，m/z322裂解產(chǎn)生m/z302，279，261，239，239；然后再對m/z279進行了MS3轟擊，產(chǎn)生m/z237，238，261的碎片。由裂解途徑可以看出，對二氮己環(huán)裂解、環(huán)丙基丟失、F丟失是主要的裂解途徑(如圖6所示)。

化合物E：產(chǎn)物混合物直接進樣得到的+ESI和EI 質(zhì)譜圖中顯示產(chǎn)物當中有一個相對分子質(zhì)量為305的產(chǎn)物。EI質(zhì)譜圖顯示相對分子質(zhì)量為305(+ESI 為306), 從[M]∶[M+2]同位素峰豐度比判斷，此化合物不含Cl。高分辨質(zhì)譜測得其精確質(zhì)量數(shù)為305.117 2(0.5)，元素組成為C15H16O3N3F，但沒能分離得到較純化合物進行NMR分析。在Dodd等[8]的研究中同樣得到相對分子質(zhì)量為305的產(chǎn)物信息，他們通過+ESI二級質(zhì)譜得到的碎片信息推斷出的化合物結(jié)構(gòu)的元素組成和我們上述的檢測結(jié)構(gòu)吻合。在反應物環(huán)丙沙星結(jié)構(gòu)基礎上，我們也認為此化合物結(jié)構(gòu)為對二氮己環(huán)開環(huán)化合物，如圖5中所示E。

圖5 可能的反應途徑

圖6 化合物D的+ESI/MSn裂解途徑及碎片歸屬

此化合物在-ESI模式下進行MSn分析得到的碎片信息較多?；衔顴在-ESI出現(xiàn)[M-H]-信號m/z304。在30%～40%的碰撞能量下，m/z304裂解產(chǎn)生m/z264，260，220；然后再對m/z260進行了MS3轟擊，產(chǎn)生m/z220，191的碎片。由裂解途徑可以看出，環(huán)丙基丟失、羧基丟失是主要的裂解途徑(如圖7所示)。

圖7 化合物E 的-ESI/MSn裂解途徑及碎片歸屬

2.3 從產(chǎn)物結(jié)構(gòu)探討氯化反應機理

從試驗得到的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)看，喹諾酮環(huán)C3位和C8位上容易發(fā)生氯代反應。氯化過程中，喹諾酮環(huán)C3位上的羧基可以脫去，并被氯取代，脫羧氯代后的產(chǎn)物(D)可以進一步在喹諾酮環(huán)C8位上氯化生成形成二氯產(chǎn)物(B)。化合物A的檢出，說明C3位和C8位上發(fā)生的氯代反應同時發(fā)生，形成的一氯產(chǎn)物同樣可以進一步發(fā)生脫羧氯代形成二氯產(chǎn)物(B)。除此以外，對二氮已環(huán)在反應過程發(fā)生了開環(huán)反應，形成不含氯的開環(huán)產(chǎn)物(E)。

Dodd等[9]依據(jù)LC/MS圖譜推導出產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，進而推測了環(huán)丙沙星的氯化反應機理。首先，他們認為HOCl與對二氮己環(huán)上仲胺的氮原子上發(fā)生氯原子取代反應形成一種不穩(wěn)定的氯胺中間產(chǎn)物R1，然后通過對二氮己環(huán)的開裂形成產(chǎn)物(E)；另一途徑則是直接在喹諾酮環(huán)8位碳上發(fā)生氯代反應。在他們的試驗中除了檢出與本試驗相同的化合物A、E以外，還推測出了另外3個可能的產(chǎn)物，分別為：C8位氯代開環(huán)化合物(R2)、對二氮己環(huán)為氨基取代(R3)及其C 8位氯代的產(chǎn)物(R4)。在他們的實驗中并沒有檢測出脫羧氯代后相關的化合物，而在我們的實驗中則分離得到多個脫羧氯代的產(chǎn)物。

在Dodd等[9]的實驗中，得到一個7位為-NH2的化合物R3，而在本試驗中，分離得到一個相似的、氨基為羥基所取代的產(chǎn)物C。我們認為，對二氮己環(huán)開裂后形成烷基胺，烷基胺發(fā)生脫烷基作用形成氨基化合物(R3)，在·OH攻擊下，喹諾酮環(huán)上的C7位上氨基被羥基取代，生成化合物R5。Torrent等[13]在研究阿特拉津氯化反應產(chǎn)物時有報道發(fā)生類似的現(xiàn)象。這個反應有可能是比較迅速的，或者R3、R5的生成量是比較少的，因此在本試驗中未能檢測到。綜合本試驗結(jié)果以及前人的研究報道，環(huán)丙沙星氯化反應途徑如圖5所示。

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