張翠仙，林朝展，楊金燕，熊天琴，鄧潔薇，韋瑀龍，趙鐘祥，祝晨蔯

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州510006)

毛冬青為冬青科(Aquifoliacae)冬青屬(IlexL.)植物毛冬青IlexpubescensHook. Et. Arn.的干燥根，是我國嶺南地區(qū)習(xí)用中藥。具有活血通脈、消腫止痛、清熱解毒之功效，臨床上廣泛應(yīng)用于治療冠心病、心絞痛和脈管炎等疾病，療效確切[1]。前期藥理活性研究表明毛冬青總?cè)圃碥站哂忻黠@降低血漿粘度的作用。在此生理活性指導(dǎo)下，前期對其乙醇提取物乙酸乙酯萃取部位的化學(xué)成分進(jìn)行了研究[2-3]?，F(xiàn)對其正丁醇部位進(jìn)行分離，得到5個(gè)三萜皂苷化合物。經(jīng)理化性質(zhì)及波譜方法鑒定其結(jié)構(gòu)為mussaendoside R(1)[4-5]、ziyu-glycosideⅠ(2)[6]、Lucyoside H(3)[7-9]、ilexoside A(4)[10]、ilexoside O (5)[10]。其中化合物1，2，3為首次從該植物中分離得到。

圖1 從毛冬青中分離得到的化合物1,2,3,4,5結(jié)構(gòu)示意圖

1 結(jié)果與討論

化合物1白色無定型粉末，φ=10%硫酸乙醇TLC于105 ℃加熱顯紫紅色，Liebermann- Burchard和Molish反應(yīng)呈陽性，表明該化合物可能為三萜皂苷類化合物。結(jié)合該化合物的1H NMR 、13C NMR及DEPT 譜(7個(gè)甲基、11個(gè)亞甲基、16個(gè)次甲基和8個(gè)季碳)得出分子C42H68O14，不飽和度9。NMR顯示1具有1個(gè)孤立羧羰基[δC177.1(s)]，1個(gè)雙鍵[δC127.7(d), 138.8(s)和δH5.51(1H, brt)]，除此外無任何其他不飽和信息，暗示此化合物含有7環(huán)。NMR還顯示該化合物結(jié)構(gòu)中具有2個(gè)連氧亞甲基[δC64.1(t), 62.2(t),δH3.81(m, 1H), 4.31(m, 1H), 4.38(m, 1H), 4.44(m, 1H) ]，8個(gè)連氧次甲基[δC74.4 (d)，78.9(d)，71.1(d)，79.2(d)，74.1 (d)，78.9 (d)，71.1 (d)，79.2 (d)，δH5.03(m, 1H), 4.75(m, 2H), 4.41(m, 1H)，4.29(t, 8.5,1H)，4.22(t, 8.5, 1H)，4.03(br d, 9.5, 1H)，3.93(t, 8.5, 1H)]和1個(gè)連氧季碳[δC73.4(s),δH5.13(1H, brs, 19α-OH)]。HPLC-ESI-MSn給出m/z819 [M+Na]+，657 [M+Na-162]+暗示化合物1可能含葡萄糖。同時(shí)NMR數(shù)據(jù)顯示有兩個(gè)端基質(zhì)子信號δC106.2 (d)，95.8 (d)，δH5.37 (1H, d, 8.5 Hz, 3-O-Glc- 1′-H)，6.32(1H, d, 8.5 Hz, 28-O-Glc-1″-H)表明1為二糖五環(huán)三萜皂苷，且分別為醇苷和酯苷鍵。

將化合物1進(jìn)行酸水解，糖的GLC分析結(jié)果表明，得到2個(gè)糖且均為β-D-葡萄糖。比較1苷元部分和ilexgenin B[10]的NMR數(shù)據(jù)(見表1)，二者基本相同。只是C-3信號由δC78.2位移至δC88.7。向低場位移了10.5，而C-28信號由δC180.7(s)位移至177.0(s)，向高場位移了3.7，表明該化合物是以ilexgenin B為苷元的三萜皂苷，其C-3羥基和C-28羧基均被苷化，形成雙糖鏈皂苷。將化合物1的數(shù)據(jù)與mussaendoside R[4-5]對照，基本一致。確定1為mussaendoside R。該化合物系首次從該植物中分得。

表1 化合物1,2,3苷元13C NMR(125 MHz)數(shù)據(jù)(溶劑:吡啶)

化合物2白色無定型粉末，φ=10%硫酸乙醇TLC于105 ℃加熱顯紫紅色，Liebermann-Burchard和Molish反應(yīng)呈陽性。HPLC-ESI-MSnm/z1 555.5[2M+Na]+、789.5[M+Na]+，627.3[M+Na- Glc]+，667.3 [M+K-Xyl]+分別出現(xiàn)碎片離子峰。結(jié)合NMR及DEPT 譜數(shù)據(jù)[7個(gè)甲基、11個(gè)亞甲基、15個(gè)次甲基和8個(gè)季碳]得出分子，分子式為C41H66O13，不飽和度9。NMR顯示2具有1個(gè)孤立羧羰基[δC177.1(s)]，1個(gè)雙鍵[δC127.7(d), 138.8(s)和δH5.51(1H, brt)]，除此外無任何其他不飽和信息，暗示此化合物含有7環(huán)。同時(shí)NMR數(shù)據(jù)顯示2有兩個(gè)端基質(zhì)子信號δC106.2 (d)，95.8 (d)，δH5.37(1H, d, 8.5 Hz，3-O-Glc-1-H)，6.32(1H, d,8.5 Hz, 28-O-Glc- 1-H)，結(jié)合HPLC-ESI-MSn給出1 555.5[2M+Na]+、789.5[M+Na]+，627.3[M+Na-162]+，667.3 [M+K-132]+暗示化合物2含有六碳糖和五碳糖，且為醇苷和酯苷。

比較化合物2和1的NMR數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)二者十分相似，區(qū)別在于苷元中C-18信號由δC47.4位移至δC54.7，向低場位移了7.3。30-CH3為α構(gòu)型時(shí)C-18位移值與β構(gòu)型相比較[10]，向低場位移(δC46.6→53.2)，故從C-18位移值δC54.6可推斷該化合物30-CH3為α-CH3構(gòu)型。而糖部分由兩個(gè)六碳糖轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋€(gè)五碳糖和一個(gè)六碳糖。將2水解后TLC顯示二糖依次為阿拉伯糖和葡萄糖。

將2波譜數(shù)據(jù)(表1和2)與文獻(xiàn)報(bào)道的ziyu-glycosideⅠ的光譜數(shù)據(jù)對照[6]，基本一致。確定2為ziyu-glycoside Ⅰ(3-O-α-L-arabinopyranosyl pomolic acid 28-O-β-D- glucopyranosyle- ster)。該化合物為首次從該植物中分離得到。

表2 化合物1，2，3糖部分13C NMR(125 MHz)數(shù)據(jù)(溶劑:吡啶)

化合物3的結(jié)構(gòu)鑒定白色無定型粉末，φ=10%硫酸乙醇TLC于105 ℃加熱顯紫紅色，Liebermann-Burchard和Molish反應(yīng)呈陽性，表明該化合物可能為三萜皂苷類化合物。HPLC- ESI-MSnm/z803.2[M+Na]+結(jié)合該化合物的1H NMR 、13C NMR及DEPT譜(7個(gè)甲基、12個(gè)亞甲基、15個(gè)次甲基和8個(gè)季碳)得出分子式：C42H68O13，不飽和度9。

NMR顯示3具有1個(gè)孤立羧羰基[δC175.0(s)]，1個(gè)雙鍵[δC123.2(d), 143.5(s)和δH4.74(1H, br s)]，除此外無任何其他不飽和信息，暗示此化合物含有7環(huán)。同時(shí)NMR數(shù)據(jù)顯示3有兩個(gè)端基質(zhì)子信號δC106.0 (d)，95.2 (d)，δH5.37(1H, d, 8.5 Hz，3-O-Glc-1′-H)，6.33(1H, d, 8.0 Hz, 28-O-Glc-1″-H)，結(jié)合HPLC-ESI-MSn給出803.2[M+Na]+，641.2[M+Na- 162]+暗示化合物3含有六碳糖和五碳糖，且為醇苷和酯苷。

比較化合物3和1的NMR數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)二者十分相似，只是苷元部分在1H NMR的高場區(qū)7個(gè)甲基全部為單峰質(zhì)子信號[δH0.82 (s, 1H)，0.91(s, 1H)，0.95(s, 1H)，0.96(s, 1H)，1.10(s, 1H)，1.27(s, 1H)和1.30(s, 1H)]；且13C NMR中減少一個(gè)連氧季碳[73.4(s)]信號。將化合物3進(jìn)行酸水解，糖的GLC分析結(jié)果表明，得到兩個(gè)糖且均為β-D-葡萄糖。將3與Lucyoside H的NMR數(shù)據(jù)對照，基本一致。確定3為Lucyoside H[7-9]，即齊墩果酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。該化合物系首次從該植物中分得。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器、試劑及藥材

北京泰克光學(xué)儀器廠X-6型熔點(diǎn)儀；美國Finnigan公司LCQDECAXP高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀；瑞士Bruker公司 AVANCE AV 400超導(dǎo)核磁共振儀。層析硅膠(200～300目)為青島海洋化工廠產(chǎn)品；溶劑和試劑均為廣州化學(xué)試劑廠分析純。

實(shí)驗(yàn)藥材購自廣州致信中藥飲片有限公司，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院祝晨蔯研究員鑒定為冬青科植物毛冬青IlexpubescensHook. Et. Arn.的干燥根，樣品保存于廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥質(zhì)量分析研究室(編號MDQ2001-1)。

2.2 提取與分離

毛冬青根(10 kg)，粉碎，用乙醇(φ=70%，30 L)于室溫下浸提5次。將提取液合并，減壓濃縮得棕褐色黏稠膏狀物(1.6 kg)。浸膏加水分散后依次用乙酸乙酯、正丁醇分配萃取，萃取液減壓濃縮，正丁醇部位得到棕褐色浸膏(400 g)。正丁醇部位(140 g)分兩次上D101大孔吸附樹脂，依次用水、φ=30%、φ=60%、φ=95%乙醇洗脫，TLC跟蹤。從φ=60%洗脫部分，經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析、ODS柱層析、Sephadex LH-20柱層析等方法分離純化得到化合物5(69 mg)，4(70 mg)，2(85 mg)，3(68 mg)，1(27 mg)。

2.3 化合物的酸水解

化合物(5 mg)用φ=9%HCl水溶液在90 ℃條件下水解5 h，反應(yīng)結(jié)束后冷卻，反應(yīng)液直接用HPLC檢測，與標(biāo)準(zhǔn)D-木糖、D-葡萄糖和L-鼠李糖對照。

2.4 化合物的物理常數(shù)和波譜數(shù)據(jù)

化合物1：白色無定型粉末，TLC，φ=10%硫酸乙醇105 ℃加熱顯紫紅色，Liebermann- Burchard和Molish反應(yīng)呈陽性。1H NMR δH(Pyr-d5): 6.32(1H, d, 8.5), 5.51(1H, brt), 5.37 (1H, d, 8.5), 5.13(1H, brs);δH3.81(m, 1H), 4.31(m, 1H), 4.38(m, 1H), 4.44(m, 1H);δH5.03(m, 1H), 4.75(m, 2H), 4.41(m, 1H)，4.29(t, 8.5,1H)，4.22(t, 8.5,1H)，4.03(br d, 9.5,1H)，3.93(t, 8.5,1H),3.23(1H, t, 12), 3.17(1H, s), 3.17(m, 1H), 2.60 (t, 9.0, 1H), 2.46 (t, 9.0, 1H), 1.73(3H, s), 1.42 (3H, s), 1.17 (3H, s), 1.15(3H, s), 0.98 (3H, d, 7), 0.93 (3H, s), 0.87 (3H, s), 0.74 (d, 9.0, 1H)。13C NMRδC(Pyr-d5)見表1和表2; HPLC-ESI-MSnm/z819 [M+Na]+, 657 [M+Na-162]+。

化合物2：白色無定型粉末，TLC，φ=10%硫酸乙醇105 ℃加熱顯紫紅色，Liebermann- Burchard和Molish反應(yīng)呈陽性。1H NMR,δH(Pyr-d5): 6.35(1H, d, 7.5)，5.52(1H, brs), 5.08(1H, brs), 4.77(1H, d, 6.8), 4.37(m, 1H), 4.36(m, 1H), 4.34(m, 1H), 4.08(m, 1H), 3.73(m, 1H), 3.22(1H, m), 3.20(1H, s), 1.27(3H, s), 1.21(3H, s), 0.98(3H, s), 0.92(3H, s), 0.82(1H, brd, 9.6), 1.70(3H, s), 1.43(3H, s), 1.01(3H, d, 7.2);13C NMRδC(Pyr-d5)見表1和表2; HPLC-ESI-MSnm/z1 555.5[2M+Na]+, 789.5[M+ Na]+, 627.3[M+Na-Glc]+, 667.3 [M+K-Xyl]+。

化合物3：白色無定型粉末，φ=10%硫酸乙醇 TLC于105 ℃加熱顯紫紅色，Liebermann- Burchard和Molish反應(yīng)呈陽性;1H NMRδH(Pyr-d5): 5.37 (1H, d, 8.5 Hz, 3-O-Glc-1′-H), 6.33 (1H, d, 8.0 Hz, 28-O-Glc-1″-H), 4.74(1H, br s), 0.82 (s, 1H)，0.91(s, 1H)，0.95(s, 1H)，0.96(s, 1H)，1.10(s, 1H)，1.27(s, 1H)和1.30(s, 1H);13C NMRδC(Pyr-d5)見表1和表2; HPLC-ESI -MSn,m/z: 803.2[M+Na]+。

化合物4：白色無定型粉末，TLC，φ=10%硫酸乙醇105 ℃加熱顯紫紅色，Liebermann- Burchard和Molish反應(yīng)呈陽性。1H NMR,δH(Pyr-d5): 6.35(1H, d, 7.8), 5.52(1H, brs), 5.10(1H, brs), 4.83(1H, d, 7.5), 3.36(1H, dd, 12.0, 3.6), 3.20(1H, s), 0.84(br d, 5.0) , 1.75(3H, s), 1.42(3H, s), 1.31(3H, s), 1.10(3H, s), 1.00(3H,d, 7.2), 0.94 (3H, s), 1.03(3H, s);13C NMRδC(Pyr-d5)： 38.9(t, C-1), 26.8(t, C-1), 88.7 (d, C-2), 39.6(s, C-3), 55.9(d, C-4), 18.7(t, C-5), 33.5(t, C-6), 40.4(s, C-7), 47.8(d, C-8), 37.0 (s, C-9), 24.7(t, C-10), 127.6 (d, C-11), 138.8 (s, C-12), 42.1(s, C-13), 29.2 (t, C-14), 26.8(t, C-15), 48.3(s, C-16), 47.2(d, C-17), 73.4(s, C-19), 42.8(d, C-20), 24.0 (t, C-21), 31.8(t, C-22), 28.2(q, C-23), 15.6(q, C-24), 16.0 (q, C-25), 17.5(q, C-26), 24.3(q, C-27), 177.0(s, C-28), 29.7 (q, C-29), 16.9(q, C-30), 107.6(d, C-1′), 75.5(d, C-2′), 78.6(d, C-3′), 71.2(d, C-4′), 67.1(d, C-5′), 95.8(d, C-1″), 74.1(d, C-2″), 79.2(d, C-3″), 71.1(d, C-4″), 78.9(d, C-5″), 62.2(d, C-6″); HPLC-ESI-MSnm/z： 1 555.5[2M+Na]+, 789.5[M+ Na]+, 805.3[M+ K], 627.3[M+Na-Glc]+, 643.3[M+K -Glc]+和511.5[M+K-Glc-Xyl]+。

化合物5： 白色無定型粉末，TLC，φ=10%硫酸乙醇105 ℃加熱顯紫紅色，Liebermann- Burchard和Molish反應(yīng)呈陽性。1H NMRδH(Pyr-d5): 6.39(1H, s), 6.32(1H, d, 8.0), 5.79(1H, d, 7.6), 5.49(1H, brs), 5.08 (1H, brs), 5.04(m, 3H), 4.88(1H, d, 6.8), 4.77(dd, 3.4, 1.2, 1H), 4.69(dd, 9.2, 3.2, 1H), 4.39～4.51(m, H), 4.26～4.36(m, H), 4.11(m, H), 4.08(m, H), 4.06(m, H), 3.88(m, 1H), 3.72(t, 11.8, 1H), 3.62(s, 1H), 3.26 (1H, dd, 11.6, 4.4), 3.17(1H, s), 2.62(tt, 12.0, 4.5, 1H), 2.48(td, 12.0, 4, 1H), 1.77(3H, d, 6.4), 1.70(3H, s), 1.37(3H, s), 1.32(3H, s), 1.10(3H, s), 1.08(3H, s), 0.97(3H, d, 7.2), 0.88(3H, s), 0.84(1H, brd, 11.6)；13C NMRδC(Pyr-d5): 38.6(t, C-1), 26.6(t, C-2), 89.4(d, C-3), 39.5(s, C-4), 55.8(d, C-5), 18.5(t, C-6), 33.3(t, C-7), 40.2(s, C-8), 47.5(d, C-9), 36.8(s, C-10), 24.5(t, C-11), 127. 4(d, C-12), 138.6(s, C-13), 41.9(s, C-14), 29.0(t, C-15), 26.4(t, C-16), 48.1(s, C-17), 47.0(d, C-18), 73.2(s, C-19), 42.6(d, C-20), 23.8(t, C-21), 31.6(t, C-22), 28.2(q, C-23), 15.4(q, C-24), 15.8(q, C-25), 17.3(q, C-26), 24.1(q, C-27), 176.8(s, C-28), 29.5(q, C-29), 16.5(q, C-30), 105.5(d, C-1′), 79.2(d, C-2′), 77.6(d, C-3′), 71.0(d, C-4′), 66.4(t, C-5′), 102.1(d, C-1″), 79.1(d, C-2″), 79.0(d, C-3″), 72.44(d, C-4″), 78.8(d, C-5″), 63.1(t, C-6″), 101.8(d, C-1?), 71.1(d, C-2?), 72.4(d, C-3?), 74.1(d, C-4?), 69.3(d, C-5?), 18.8(q, C-6?), 95.6(d, C-1″″), 73.9(d, C-2″″), 78.8(d, C-3″″), 70.9(d, C-4″″), 78.2(d, C-5″″), 63.2(t, C-6″″); HPLC-ESI-MSnm/z：1 097.6[M+Na]+, 1 113.2[M+K]+, 935.4[M+Na-Glc]+, 951.2[M+K-Glc]+, 967.3[M+K-Rha]+, 789.4[M+Na-Glc-Rha]+, 627.2 [M+Na-Glc-Rha-Glc]+, 477.1[M+Na-Glc- Rha -Glc-Xyl]+。

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