劉洪博，姚 麗，蘇火生 ，劉新龍，應(yīng)雄美，蔡 青 ，吳才文

（1.云南省農(nóng)業(yè)科院甘蔗研究所，開遠(yuǎn)661600；2.云南省甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，開遠(yuǎn)661600；3.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，昆明650223）

甘蔗是一種重要的糖料作物，近年來(lái)甘蔗病蟲害已成為制約甘蔗產(chǎn)量的主要因素，在甘蔗苗期，甘蔗螟蟲的危害對(duì)甘蔗產(chǎn)量的影響較大。而常規(guī)育種途徑因抗性種質(zhì)資源的匱乏而難以解決。因此利用基因工程技術(shù)，將目標(biāo)基因CpTI基因進(jìn)行了5'添加信號(hào)肽、3'添加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)（signal-cpti-KDEL，簡(jiǎn)稱sck[1-3]）修飾，從而使基因定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，免遭細(xì)胞內(nèi)部的降解，大幅度提高外源蛋白在轉(zhuǎn)基因植株中的積累水平[4]。修飾后的蘇云金芽孢桿菌毒蛋白基因（Bt）[5]和豇豆蛋白酶抑制基因（CpTI）[6]導(dǎo)入甘蔗，為甘蔗抗蟲育種提供新材料，培育出抗蟲甘蔗新品種。本研究通過(guò)前人構(gòu)建的植物表達(dá)載體（含雙T-DNA（transfer DNA）的雙抗蟲基因），借助農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化到甘蔗中，對(duì)潮霉素抗性篩選出的甘蔗苗進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)研究，利用sck引物對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行CpTI基因的檢測(cè)，驗(yàn)證CpTI基因是否固定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，或是被降解。

1 材料與方法

1.1 材料

通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因甘蔗的抗性篩選，初步獲得兩個(gè)甘蔗品種的抗性植株，分別是福農(nóng)94-0403和P44兩個(gè)品種，一共10株抗性植株，另外取兩個(gè)非轉(zhuǎn)基因植株作為陰性對(duì)照，并將其轉(zhuǎn)入苗床移栽，待植株長(zhǎng)成20cm左右，取植株的正一葉和正二葉作為RT-PCR的檢測(cè)材料，標(biāo)記好順序后，儲(chǔ)存于-70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑與方法

RNA提取試劑盒購(gòu)自TIANGEN公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒TransScript First-Stand cDNA Synthesis購(gòu)自全式金公司。其它試劑均購(gòu)自上海生工。在提取RNA前，將所用離心管和槍頭等用0.1%的DEPC水浸泡過(guò)夜，然后121℃高壓濕熱滅菌30 min，研缽、燒杯等用200℃烘箱高溫干熱滅菌8h。將材料從-70℃冰箱中取出，利用液氮研磨法將葉片磨碎，取50mg左右的研磨樣品進(jìn)行RNA提??；將提取的RNA利用瓊脂糖凝膠檢測(cè)和OD值分析，經(jīng)檢驗(yàn)合格后取相同含量總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，RT-PCR的引物序列為:

SCK1:5'AAA ATG AAG AGC ACC ATC TTC 3'

SCK2:5'TCT AGA GTT CAT CTT TCT CAT C 3'

反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)體系模板cDNA定量為20ng,其它PCR反應(yīng)液按20μL的反應(yīng)體系進(jìn)行，RT-PCR的循環(huán)程序?yàn)?94℃ 5min，94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 8min。 配制 1.2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，用全式金公司的Trans2k DNA marker作對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA提取質(zhì)量分析

用TRNzol-A＋提取的RNA經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠檢測(cè)如圖所示，經(jīng)OD值檢測(cè)表明，10個(gè)被檢測(cè)樣品中，RNA的OD260/OD280分別在1.80到2.01之間，表明蛋白污染較少，OD260/OD230分別在1.9到 2.3之間，表明無(wú)鹽離子污染。從圖1可以看出，RNA條帶清晰，沒(méi)有降解現(xiàn)象，說(shuō)明RNA的完整性較好，無(wú)DNA的污染，符合cDNA合成的要求。

2.2 RT-PCR檢測(cè)分析

通過(guò)對(duì)10個(gè)檢測(cè)樣本的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后，取定量的反轉(zhuǎn)錄底物進(jìn)行RT-PCR，結(jié)果表明：10個(gè)檢測(cè)樣本中，材料P44中出現(xiàn)一個(gè)陽(yáng)性，即20號(hào)；福農(nóng)94-0403出現(xiàn)兩個(gè)陽(yáng)性材料，分別為25、26號(hào)，而正常的陰性對(duì)照植株都沒(méi)有出現(xiàn)條帶，如圖2所示。

圖1 RNA瓊脂糖凝膠電泳

3 討論

通過(guò)對(duì)模板cDNA進(jìn)行定量后，從RT-PCR的檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，CpTI基因在植株體內(nèi)得到了表達(dá)，但檢測(cè)的條帶較弱，其中CpTI基因在P44材料中的表達(dá)較強(qiáng)，條帶的亮度較為明顯，而在福農(nóng)94-0403材料中檢測(cè)的兩個(gè)目的基因表達(dá)較弱，條帶亮度不是很明顯，目的基因在植株體內(nèi)表達(dá)量不是很高，從修飾的豇豆蛋白酶抑制基因來(lái)看，目的基因在轉(zhuǎn)入甘蔗后并沒(méi)有被降解，說(shuō)明此基因整合到了細(xì)胞的特定部位，本實(shí)驗(yàn)采用的是已經(jīng)廣泛應(yīng)用于玉米、小麥及水稻等單子葉中的組成型啟動(dòng)子玉米Ubi-1啟動(dòng)子，啟動(dòng)效率較高，并從檢測(cè)的兩種材料來(lái)看，可能目的基因的表達(dá)量與轉(zhuǎn)基因受體材料有關(guān)，也可能在目的基因轉(zhuǎn)入甘蔗中，整合的部位不同，從而受到影響。

圖2 轉(zhuǎn)基因植株RT-PCR檢測(cè)電泳

4 結(jié)論

RT-PCR在轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè)中具有重要的意義，它可以作為轉(zhuǎn)基因植株抗性篩選后的初步檢測(cè)，與總DNA的PCR檢測(cè)方法相比，RT-PCR能夠更準(zhǔn)確的在表達(dá)水平上檢測(cè)目的基因，在底物固定的條件下，還能夠相對(duì)檢測(cè)出目的基因在植株體內(nèi)的表達(dá)水平。本實(shí)驗(yàn)利用RT-PCR所檢測(cè)出的3個(gè)轉(zhuǎn)基因植株，證明CpTI基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入植株，并已經(jīng)得到表達(dá)；在相同底物的前提下，PCR產(chǎn)物量有所不同，證明相同的目的基因，在材料P44中的表達(dá)量較高，而在材料福農(nóng)94-0403中的表達(dá)量較低，PCR的條帶較暗。但RT-PCR在證明目的基因在植株體內(nèi)表達(dá)功能具有一定的局限性，因此，本實(shí)驗(yàn)的3株轉(zhuǎn)基因植株還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證其功能的表達(dá)。

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