張 輝 ，王華忠 ，2，3

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所，哈爾濱150080；2.黑龍江省普通高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點實驗室/黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院，哈爾濱 150080；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北方糖料作物資源與利用重點開放實驗室，哈爾濱 150080）

甜菜是我國主要的糖料作物之一，長期以來通過常規(guī)育種在產(chǎn)量、質(zhì)量及抗病性方面并沒有取得突破性的進展。航天誘變育種是近些年來新發(fā)展起來的一種新的誘變育種方法，大大提高了作物突變的頻率，使作物在形態(tài)特征、經(jīng)濟性狀、生育性狀方面發(fā)生較大變異。劉華君、王燕飛等（1996）研究發(fā)現(xiàn)不同倍性的甜菜種子通過衛(wèi)星搭載誘變處理后，會表現(xiàn)出不同的敏感性，與對照相比，四倍體材料部分性狀在生長過程中受到抑制，生育期延遲，對二倍體材料的生長有明顯的促進作用，生長勢增強，初步說明外層空間環(huán)境不僅影響植物的生理狀態(tài)，也影響植物的遺傳基因[1]。王華忠等對8個甜菜航天育種材料及其對照進行田間觀察及葉綠素含量分析，研究結(jié)果表明一年生航天材料與對照比較，在整個期間葉綠素含量均表現(xiàn)出較高的趨勢，說明對于增強光合作用，提高生物產(chǎn)量具有較好的效果。二年生材料在葉叢生長期表現(xiàn)生長遲緩，有的少數(shù)植株葉片變窄，個別生長畸形，而到了抽薹期，則表現(xiàn)為抽薹率低[2]。劉乃新等以航天誘變的3個不同甜菜品系及其對照為材料，對生殖生長階段的甜菜葉片的4種激素（IAA、GA、ABA和ZR）含量進行了測定，結(jié)果表明航天誘變材料發(fā)生了很大的變化[3]。但對于甜菜航天誘變材料同工酶譜分析方面還未有相關(guān)報道。同工酶一詞是Markert和Moller于1957年提出來的[4]，可用于研究物種進化、遺傳變異、雜交育種和個體發(fā)育、組織分化等，同工酶能在一定程度上反映蛋白質(zhì)水平上的信息[5-7]，植物體內(nèi)不同酶的同工酶譜隨著細胞分化、組織器官及植株的生長、成熟發(fā)生規(guī)律性的變化，這種變化在一定程度上反映了植物在發(fā)育過程中基因表達的時空順序性，因而同工酶的酶譜特征可以作為植物生長發(fā)育和遺傳轉(zhuǎn)化的一種生理生化指標(biāo)[8-9]。該試驗利用同工酶酶譜分析的方法研究航天誘變后的SP3代材料在生理生化水平上的變異，旨在為下一步探討分子水平的變異性及研究變異對甜菜田間性狀的影響提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料為搭載我國第一顆航天育種衛(wèi)星“實踐八號”的甜研202、甜研207、甜研212、甜研425、甜研單粒-86的SP3代衍生材料及其對照。其中甜研202、甜研207、甜研212為二倍體材料；甜研425為四倍體材料；甜研單粒-86為單粒種材料。試驗用甜菜二年生材料母根栽植時期為2010年4月27日，于2010年6月20日、7月14日取樣，分別為甜菜的盛花期、抽薹期。

1.2 試驗方法

1.2.1 酶液提取 取預(yù)處理的甜菜葉片1.0g放入預(yù)冷的研缽中，加入預(yù)冷的1.5mL 0.02mol/L KH2PO4和0.1g PVP（聚乙烯吡咯烷酮），快速研磨成勻漿后，于離心機上5000r/min 4℃離心15min，取上清液加入等體積的10%甘油混勻，放置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 電泳 該試驗采用不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為2.4%。

1.2.3 染色 POD同工酶染色利用聯(lián)苯胺染色[10]；EST同工酶染色采用醋酸萘酯-堅牢藍染色法[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜菜航天誘變SP3代二年生材料盛花期同工酶譜分析

2.1.1 二年生材料盛花期POD同工酶譜分析 為了研究方便，按同工酶譜帶遷移率和顏色的不同分別將POD、EST酶譜分為A、B、C三個區(qū)域。表1為SP3代二年生育種材料各品系與盛花期POD、EST電泳圖譜中序號對應(yīng)表格。由SP3代二年生育種材料盛花期POD同工酶電泳（圖1）可知，該圖譜中總條帶數(shù)為8條酶帶，四倍體衍生材料HT2-425-1和HT2-425-2條帶間無差異性，二者較對照在B區(qū)多出兩條帶；單粒種衍生材料HT8-86較對照在A區(qū)多出1條帶；二倍體衍生材料不同品系：HT6-212-2較對照在B區(qū)多出1條酶帶，HT6-212-1、HT6-212-4較對照分別在A、B區(qū)域各多出1條酶帶，但二者在B區(qū)多出的條帶位置不一致。HT6-212-3與對照相比在A區(qū)多出 1 條 帶。 HT5-207、HT5-207-1、HT5-207-2-1、HT5-207-2-5較對照均在B區(qū)多出兩條帶，但HT5-207較對照在C區(qū)缺失1條帶。HT5-207-2-3、HT5-207-3、HT5-207-2-4、較對照在B區(qū)多出 1條帶，HT4-202較對照在各區(qū)均多出1條帶。

2.1.2 二年生材料盛花期EST同工酶譜分析 由SP3代二年生育種材料盛花期EST同工酶電泳 （圖2）可知，該電泳酶譜總條帶數(shù)為8條。單粒品系HT8-86較對照在B區(qū)缺失1條酶帶；四倍體品系HT2-425-1、HT2-425-2較對照無條帶差異性；二倍體品系中：HT6-212-4、HT6-212-1較對照條帶無差異性，而HT6-212-3、HT6-212-2較對照分別在C區(qū)多出1條酶帶，在B區(qū)少了1條酶帶。HT4-202較對照在B區(qū)多出 1 條酶帶。HT5-207、HT5-207-2-1、HT5-207-1、HT5-207-2-4較對照分別在B區(qū)多出1條酶帶，HT5-207-2-2、HT5-207-2-3較對照無差異性，HT5-207-3較對照在C區(qū)缺失1條帶，HT5-207-2-5較對照在B、C區(qū)各缺失1條酶帶。

2.2 甜菜航天誘變SP3代二年生材料抽薹期同工酶譜分析

2.2.1 二年生材料抽薹期POD同工酶譜分析 表2為SP3代二年生育種材料各品系與抽薹期POD、EST電泳圖譜中序號對應(yīng)表格，圖3為二年生材料抽薹期POD同工酶譜。由該圖譜分析可知，該電泳圖譜總條帶數(shù)為8條。單粒種材料HT8-86較對照在B區(qū)多出1條酶帶；多倍體材料HT2-425-1、HT2-425-2較對照分別在B、C區(qū)缺失了1條帶，且各個條帶區(qū)域顏色均要淺于對照；二倍體品系材料中：HT6-212-1與HT6-212-2帶型一致，較對照分別在B、C區(qū)多出1條帶。HT6-212-4較對照均在B區(qū)多出1條酶帶，且各區(qū)酶帶的顏色均要深于對照。而HT6-212-3同對照相比在B區(qū)缺失1條帶，而在C區(qū)多出1條帶。HT5-207-1、HT5-207-2-4、HT5-207-2-5、HT5-207-2-3、HT5-207-2-2較對照分別在B、C區(qū)多出1條帶。HT5-207-2-1較對照在B區(qū)缺失了1條帶,而在C區(qū)多出1條酶帶，HT5-207較對照在B區(qū)缺失了1條酶帶。HT5-207-3較對照無條帶差異性。HT4-202-3較對照無條帶差異性。HT4-202較對照分別在B、C缺失1條帶。

表1 盛花期POD、EST電泳圖譜中各品系對應(yīng)序號

圖1 SP3代二年生育種材料盛花期POD同工酶圖譜（上端為正極，下端為負極）

圖2 SP3代二年生育種材料盛花期EST同工酶圖譜（上端為正極，下端為負極）

表2 抽薹期POD、EST電泳圖譜中各品系對應(yīng)序號

圖3 SP3代二年生育種材料抽薹期POD同工酶圖譜（上端為正極，下端為負極）

2.2.2 二年生材料抽薹期EST同工酶譜分析 由SP3代二年生材料抽薹期EST同工酶圖譜 （圖4）分析可知，該電泳圖譜總條帶數(shù)為9條。單粒種材料HT8-86較對照在B區(qū)缺失1條酶帶；四倍體材料HT2-425-1、HT2-425-2較對照帶間無差異性；二倍體材料中HT6-212-3、HT6-212-4較對照條帶間無差異性，HT6-212-2較對照在B區(qū)缺失了1條帶，HT6-212-1較對照分別在B、C區(qū)多出1條酶帶。HT4-202較對照在B區(qū)多出兩條酶帶，HT4-202-3較對照在B區(qū)多出1條酶帶，HT5-207-1、HT5-207-2-4、HT5-207-2-1、HT5-207、HT5-207-2-2較對照在B區(qū)多出1條酶帶，但HT5-207-1、HT5-207-2-2、HT5-207-2-1與HT5-207-2-4、HT5-207在B區(qū)多出的條帶位置不同，其中HT5-207較對照在A區(qū)缺失了1條帶。HT5-207-3較對照在C區(qū)缺失1條帶。HT5-207-2-5、HT5-207-2-3較對照條帶間無差異性。

圖4 SP3代二年生育種材料抽薹期EST同工酶圖譜（上端為正極，下端為負極）

3 討論與結(jié)論

同工酶在一定程度上能反映蛋白質(zhì)水平上的信息，植物體內(nèi)不同酶的同工酶譜隨著細胞分化、組織器官及植株的生長、成熟發(fā)生規(guī)律性的變化，這種變化在一定程度上反映了植物在發(fā)育過程中基因表達的時空順序性，因而同工酶的酶譜特征可以作為植物生長發(fā)育和遺傳轉(zhuǎn)化的一種生理生化指標(biāo)。該試驗以SP3代衍生育種材料及其對照為試驗材料，對不同倍性材料各品系進行了同工酶酶譜的差異性研究分析，結(jié)果表明：（1）甜菜航天誘變SP3代二年生材料在盛花期、抽薹期的EST、POD同工酶譜分析中，各個品系材料間表現(xiàn)出一定的差異性，航天誘變材料較對照條帶數(shù)基本呈增多趨勢，且酶活性高于對照；（2）兩個時期的同工酶譜圖相比較分析表明，EST、POD同工酶譜在這兩個時期總條帶數(shù)基本沒有太大變化；（3）航天誘變后不同倍性材料之間，二倍體材料變異率明顯高于四倍體材料、單粒種材料。導(dǎo)致出現(xiàn)以上結(jié)果的原因可能是太空輻射誘變是一個很復(fù)雜的過程，射線的能量沉積在物質(zhì)上，引起物質(zhì)的原子和分子的激發(fā)與電離，電離過程可以形成自由基，自由基與DNA相互作用可以引起DNA多種類型的損傷，包括堿基變化、脫落、氫鍵的斷裂、單雙鍵的斷裂、DNA及蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子之間的交聯(lián)[12－13]，從而導(dǎo)致航天誘變后材料在同工酶水平發(fā)生變化。航天過程的條件極為復(fù)雜，能夠使植物遺傳性發(fā)生變異常常是以微重力和強輻射為主要因素的多因素的綜合效應(yīng)。該試驗研究結(jié)果表明誘變后SP3代衍生材料較對照在生理生化水平上表現(xiàn)出一定的差異性，說明在空間復(fù)雜的環(huán)境條件下，不同個體變異是多樣的。但該變異在甜菜育種工作的具體應(yīng)用有待于進一步研究確定。

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